劉曉帆 楊瑤珺 吳麗潔 徐佳

水蛭是一味傳統(tǒng)藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草對它均有記錄。近年來，由于人們發(fā)現(xiàn)其對心腦血管疾病具有很好的治療作用，在臨床上，也越來越多的用于腦血栓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及腦水腫的治療[1]。另據(jù)報道，水蛭亦可以用于糖尿病腎病的治療[2]。因此，水蛭的臨床研究及藥學(xué)研究也越來越廣泛, 現(xiàn)就生藥學(xué)近年來的研究概況綜述如下。

1 原動物品種的研究

《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2010年版收載3種水蛭，分別為蛭科動物螞蟥WhitmaniapigraWhitman、柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman，水蛭HinudonipponicaWhitman的干燥體[3]。

需要指出的是，《中國藥典》和《中國動物志》所記載的這三種水蛭在名稱及歸屬上面有很大的不同，《中國動物志》將螞蟥WhitmaniapigraWhitman、柳葉螞蟥WhitmaniaacranulataWhitman分別稱作寬體金線蛭與尖細(xì)金線蛭，屬于黃蛭科。而水蛭HinudonipponicaWhitman稱為日本醫(yī)蛭，屬于醫(yī)蛭科[4]。它們的習(xí)性也完全不同，前兩者以田螺、蚌類等軟體動物為生，后者則以吸食血液為生。有報道稱后者具有抗凝血作用，而前兩者未見有這種作用的報道。

綜合歷代本草及近年來水蛭的動物研究進(jìn)展，筆者認(rèn)為，《中國藥典》的來源欠妥。根據(jù)歷代文獻(xiàn)對水蛭的性狀、生存環(huán)境、食性等方面的描述，歷代本草所記載的水蛭應(yīng)為吸血的日本醫(yī)蛭或麗醫(yī)蛭(屬于醫(yī)蛭科)，而不應(yīng)該是不吸血的寬體金線蛭和尖細(xì)金線蛭[5]。另外，《中國藥典》將寬體金線蛭稱之為“螞蟥”亦不太恰當(dāng)，“螞蟥”一名始出于《圖經(jīng)本草》，原意是指吸血的水蛭，直到今天，人們也將吸血的蛭類稱作螞蟥。同理，柳葉螞蟥也應(yīng)改稱為尖細(xì)金線蛭為妥。

2 水蛭藥材鑒定研究

目前報道了一系列關(guān)于水蛭藥材鑒定方面的研究，主要包括：性狀鑒定、理化鑒定等方面，顯微鑒定、DNA條形碼部分未見報道。

2.1 性狀鑒別

在藥材市場上，水蛭有三種規(guī)格，分別為：清水曬干、清水燙死、礬水殺死。在價格上呈現(xiàn)遞減趨勢，至于三種規(guī)格的質(zhì)量如何，未見有文獻(xiàn)報道。但大部分學(xué)者認(rèn)為，質(zhì)量較好的水蛭在性狀上應(yīng)有以下特征：外觀背部有自然的黑色光澤，折斷時有韌性感，斷面有膠質(zhì)樣光澤，味淡且有魚腥氣，手摸肉質(zhì)有彈性[6-7]。筆者在進(jìn)行市場調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，寬體金線蛭為主要品種，清水曬干和清水燙死這兩種規(guī)格占主導(dǎo)地位。

2.2 顯微鑒定

目前沒有關(guān)于顯微鑒定的專門文獻(xiàn)報道，不過張貴君[8]在《常用中藥顯微鑒定》一書中指出水蛭的粉末鑒別特征為纖維、表皮細(xì)胞與縱肌纖維細(xì)胞。但是根據(jù)筆者的驗證發(fā)現(xiàn)，水蛭正品與偽品在這些方面幾乎一模一樣，無法進(jìn)行鑒別。該方法只能用于水蛭類藥材與其他藥材的鑒別。

2.3 理化鑒別

《中國藥典》2010版的檢測方法為薄層色譜和浸出物含量的檢測。筆者經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)，正品和混偽品均可以與標(biāo)準(zhǔn)藥材在相同位置形成相同的紫紅色的點，很難鑒別。浸出物的含量表明，在正品的范圍中，清水曬干的浸出物含量最高，清水燙死次之，礬制最低。與偽品的橫向比較未找出明顯差別。所以，很多學(xué)者就報道了其他的一些理化檢測方法，主要為毛細(xì)管電泳法。

江佩芬等[9]利用電泳技術(shù)，測定寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、尖細(xì)金線蛭、光潤金線蛭的電泳譜帶，發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭和日本醫(yī)蛭的電泳譜帶相似，尖細(xì)金線蛭的電泳譜帶略有區(qū)別，光潤金線蛭的電泳譜帶與它們3種有些不同，但是這4種水蛭均有兩條主要電泳譜帶A3和B1。因為水蛭的主要成分是蛋白質(zhì)，所以從化學(xué)成分的角度說，這4種水蛭可能存在有相同的蛋白質(zhì)，但是以《中國藥典》收載的3個品種寬體金線蛭、日本醫(yī)蛭、尖細(xì)金線蛭的蛋白類成分較為相似。

另外，劉興國等[10]采用高效毛細(xì)管電泳法對寬體金線蛭和混淆品菲牛蛭進(jìn)行蛋白多肽的分析，發(fā)現(xiàn)寬體金線蛭與菲牛蛭的高效毛細(xì)管電泳圖譜之間有明顯差異，重復(fù)性良好。

2.4 DNA條形碼驗證

DNA 條形碼技術(shù)是近來發(fā)展起來的物種鑒定新方法，通過對基因組中一段短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段進(jìn)行分析從而對物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，成為生物分類和鑒定的研究熱點和方向。尤其適用于來源于生物體部分組織或器官的中藥材的真?zhèn)舞b定[11-12]。運用DNA條形碼，可以很好的對水蛭的品種進(jìn)行快速、有效的鑒定。但是現(xiàn)在這方面還未見報道。

3 含量測定和指紋圖譜

《中國藥典》的水蛭的含量測定的方法是進(jìn)行凝血酶效價的評價，通過這種評價方法可以大致了解水蛭凝血作用的強弱，這種整體評價方法符合中藥普遍存在的多成分、多靶點的特點。但是，經(jīng)過筆者的驗證，發(fā)現(xiàn)這種方法存在無法判別何時開始凝結(jié)的問題，有著較大的誤差。

文獻(xiàn)報道方面，大多采用高效液相色譜和紫外光譜法來測定水蛭內(nèi)各種有效成分的含量，其中包括：氨基酸、次黃嘌呤、黃嘌呤、總磷脂、總多糖、生物活性物質(zhì)等等。

通過柱前衍生化法測定水蛭內(nèi)氨基酸含量發(fā)現(xiàn)，水蛭內(nèi)游離氨基酸含量和總氨基酸含量大多維持在2.9 mg/ml和4.1 mg/ml左右[13-14]。

丁冠華[15-16]采用Folch試劑超聲提取，鉬藍(lán)試劑顯色和乙醚回流提取，苯酚-硫酸顯色的方法，分光光度法分別測定兩種藥材不同商品中總磷脂和總多糖的含量。得出水蛭中總磷脂含量以磷含量計算，在2.38～71.4 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程Y=0.0238X-0.01(r=0.9994)?？偠嗵呛恳云咸烟怯?在18.54～92.68 μg范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系,回歸方程Y=0.0045X+0.0012(r=0.9998)。

次黃嘌呤為最常見的水蛭含量測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但是次黃嘌呤的藥理作用為陣痛、止咳等，與水蛭主要的藥理作用差別很大，筆者認(rèn)為，次黃嘌呤可能不能作為水蛭質(zhì)量鑒別的標(biāo)準(zhǔn)品。

王艷[17]、張永太[18]等運用仿生酶水解、乙醇提取等提取方法，運用高效液相測定，均取得了良好的效果。但是含量較低，是否有鑒定依據(jù)，需要進(jìn)一步的考察。

部分學(xué)者還對不同產(chǎn)地、不同品種的水蛭進(jìn)行了指紋圖譜的研究，但是所運用的標(biāo)準(zhǔn)品只有次黃嘌呤，其他峰的歸屬還需要進(jìn)一步的研究[19-20]。

4 化學(xué)成分研究

水蛭的化學(xué)成分以大分子蛋白質(zhì)、多肽等物質(zhì)為主。也是現(xiàn)在研究的主流范圍，而微量元素等小分子物質(zhì)則研究較少。

4.1 蛋白質(zhì)及多肽等大分子物質(zhì)

目前文獻(xiàn)報道了一系列水蛭具有抗凝作用的多肽類成分，包括水蛭素、肝素、組織胺、氨基酸和其他多肽類物質(zhì)等。并通過化學(xué)和藥理研究，基本否定了水蛭素為中藥水蛭(藥材)的有效成分，但是對于其有效成分的確定，還需要進(jìn)一步的研究。

4.1.1 水蛭素 目前，人們對水蛭素的研究最為透徹。一百多年前，人們就發(fā)現(xiàn)了在水蛭提取物中有抗凝血的成分，上世紀(jì)50年代，Markwardt成功分離出這種物質(zhì)，定名為水蛭素。顧銀良等[21]對它的組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它是含有66個氨基酸的單鏈多肽。長期以來，人們一直認(rèn)為水蛭素是水蛭的有效成分，但是最近的研究表明，水蛭素只存在于新鮮水蛭的唾液中，且胃蛋白酶會破壞它的活性[22]。所以，在干燥藥材中水蛭素含量微乎其微，經(jīng)過煎煮和人口服后，在水解作用和胃蛋白酶作用下，會損失殆盡。但是長期的臨床實踐表明，水蛭的常用方法的確為煎煮和口服，而且亦具有很好的抗凝血作用。因此，對于水蛭素是水蛭的有效成分的論調(diào)，筆者認(rèn)為沒有科學(xué)依據(jù)。現(xiàn)在，研究人員已成功合成人造的重組水蛭素，用于科學(xué)研究，低濃度的重組水蛭素還用于心腦血管疾病的治療和預(yù)防。

4.1.2 氨基酸 水蛭含有17種氨基酸,包括人體必需的8種氨基酸，瞿新艷[23]通過觀察干燥的寬體金線蛭提取物對小鼠凝血、出血時間和家兔離體血漿復(fù)鈣時間的影響，發(fā)現(xiàn)水蛭低極性(石油醚提取)提取物可以延長小鼠凝血、出血時間和家兔的血漿復(fù)鈣時間。通過對水蛭低極性提取物的測定，發(fā)現(xiàn)提取物中游離氨基酸的含量豐富，因此推測游離氨基酸可能是水蛭抗凝血作用的主要有效成分。

4.1.3 其他大分子類成分 近年來，有文獻(xiàn)報道表明可從水蛭中分離得到具有較好抗凝活性的多肽類成分。比如，貴艷麗等[24]利用仿生親和介質(zhì)庫進(jìn)行配體篩選和1步純化的方法，從日本醫(yī)蛭中純化出了1種具有抗凝血活性的新型低豐度蛋白質(zhì)，命名為NLP-1( new leech protein-1)。通過進(jìn)一步分析, 其相對分子質(zhì)量為13800，蛋白回收率可達(dá)到69.2%，在血漿中含量為0.02 mg/ml時即可產(chǎn)生明顯的抗凝血現(xiàn)象。鐘山等應(yīng)用Sephadex DEAE A-50陰離子交換樹脂色譜、Sephadex G-25和Sephadex LH-20凝膠過濾色譜以及反相高效液相色譜對寬體金線蛭干體進(jìn)行了分離純化，得到了一個抗凝血多肽，命名為“螞蟥多肽 (whitmamn)”，其相對分子量為8608，推測其結(jié)構(gòu)為63個氨基酸殘基形成的肽鏈上連接一個分子量為1898的糖鏈[25-26]。

4.2 小分子成分

近年來，針對水蛭中的大分子成分進(jìn)行了很詳盡的研究，下面討論一下近些年從水蛭中提取分離的小分子活性成分。

4.2.1微量元素 實驗研究表明，水蛭中含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等14種元素[27]。閆繼東等[28]經(jīng)過研究，認(rèn)為水蛭可能通過調(diào)節(jié)病人體內(nèi)微量元素變化引起的紊亂，從而達(dá)到治療疾病的作用。

4.2.2 其他小分子物質(zhì) 目前，從水蛭中分離得到的小分子成分主要為喋啶類、糖脂類、不飽和脂肪酸和甾體類化合物等。鄭云楓等對寬體金線蛭的小分子成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3種具有抗缺氧活性的喋啶類雜環(huán)新化合物，分別命名為水蛭甲素、水蛭乙素和水蛭丙素。李友賓等[29]從日本醫(yī)蛭中也得到3個喋啶類化合物:hirudinoidine A-C。這是首次從日本醫(yī)蛭中得到噻吩并喋啶結(jié)構(gòu)的化合物。黃榮清等[30]運用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，分析得出水蛭中有很強的抗凝血活性提取物中的15 個化合物，主要為不飽和脂肪酸甲酯、甾體等。其中含有：己醛、4-甲基十四烷酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、11-十六碳烯酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、11-甲基十六烷酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、13-十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、10-十九烯酸甲酯、13-二十二烯酸甲酯、2-乙酰氧基-7,9-十九烯酸甲酯、膽固醇、膽甾-5,7-二烯-3-酮。

5 總結(jié)與展望

通過對水蛭生藥學(xué)和化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)《中國藥典》關(guān)于水蛭品種存在描述不清，分類錯誤等問題。在藥材鑒定方面，傳統(tǒng)的鑒定方法僅僅可以在正品范圍內(nèi)大致評價水蛭的質(zhì)量，文獻(xiàn)報道也大多為此，但是無法鑒別正品與偽品。DNA條形碼可以很好的解決這個問題，但目前沒有相關(guān)報道。含量測定和指紋圖譜方面，由于標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏和對水蛭有效成分研究的欠缺，現(xiàn)只能用次黃嘌呤和氨基酸來部分的判斷水蛭質(zhì)量，缺乏依據(jù)。所以筆者初步認(rèn)為，今后水蛭的研究重點應(yīng)放在藥理方面，研究出究竟是什么成分在發(fā)揮抗凝血作用，只有這樣才能科學(xué)、有效的評價水蛭的質(zhì)量。

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