俞聯(lián)平，郝正里，李發(fā)弟，3＊，孟祥君，陳興榮，李新媛

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室 甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，甘肅 蘭州730070；2.甘肅省動物營養(yǎng)研究所，甘肅 蘭州730010；3.甘肅省飼料工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州730070）

＊岷山紅三葉 （Trifoliumpratense）作為甘肅省具有地域特點的地方選育品種，不僅抗寒耐濕，產(chǎn)草量高、質(zhì)優(yōu)，且富含異黃酮（isoflavone，ISO），是集草藥為一體的優(yōu)良豆科牧草。經(jīng)檢測岷山紅三葉牧草中異黃酮含量為1.0%～2.6%［1，2］，為大豆籽實中異黃酮含量（0.1%～0.3%）［3］的近10倍，其異黃酮以鷹嘴豆芽素 A（biochanin A）和芒柄花素（formonetin）含量最高，占牧草干重的0.1%～0.9%，而大豆籽粒以染料木素（genistin）和大豆黃素（daidzin）為主，僅占籽粒干重的0.04%～0.19%［4］，且豆科作物中異黃酮含量隨環(huán)境因素如生態(tài)氣候條件、季節(jié)和土壤條件等變化［5］。研究表明，異黃酮類物質(zhì)具有與雌二醇（estradiol，E2）相似的結(jié)構(gòu)，不僅有微弱的雌激素活性和抗雌激素作用，還具有抗氧化、降低膽固醇、抗腫瘤、改善心血管機能等一系列重要的生物學功能［6－8］。同時，其作為一種生理調(diào)節(jié)劑，能改變動物血液中催乳素（prolactin，PRL）、生長激素（growth hormone，GH）、睪酮（testosterone）等內(nèi)源性激素的水平，家畜日糧中添加適量的異黃酮，可提高其生產(chǎn)性能、繁殖性能，增強機體免疫力等［9－14］，但采食過量時，則會引起家畜，特別是反芻家畜的繁殖機能紊亂［15］。目前國內(nèi)外對大豆異黃酮的研究比較深入，但對紅三葉異黃酮提高畜禽機體免疫力、調(diào)節(jié)動物鈣磷代謝以及促進其生長，改善其生產(chǎn)性能和繁殖性能等方面的作用及作用機理的研究還有待進一步深入和系統(tǒng)化，針對岷山紅三葉異黃酮藥理作用、對畜禽生產(chǎn)的有益作用及作用機理等方面的研究尚未見報道。

岷山紅三葉異黃酮由于其來源的天然性，以及原始無污染的自然生產(chǎn)環(huán)境，作為畜禽飼料添加劑應(yīng)用，不存在抗生素和化學藥品所具有的畜產(chǎn)品殘留和環(huán)境污染等安全隱患［16］。進行本試驗是為探討岷山紅三葉異黃酮在促進動物生長，提高機體抗氧化能力和免疫機能等方面的作用，以便確定其作為無公害綠色飼料添加劑開發(fā)的價值，及提高畜禽抗疾病、抗應(yīng)激能力，改善動物生產(chǎn)性能的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2008年12月13日－2009年2月11日在甘肅省中醫(yī)學院動物實驗中心進行［動物實驗設(shè)施合格證SYXK（甘）2004－0006］。

1.2 試驗設(shè)計、動物與分組及試驗期

采用單因素完全隨機分組試驗設(shè)計。選擇80只50～60日齡、體重接近200 g、CL級（clean grade）的SD雌性大鼠［蘭州中醫(yī)學院動物試驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（甘）2004－0006］作為試驗動物，隨機分為8組，每組10只；其中1～7組去卵巢（ovariectomized，OVX），分別施予不同劑量的紅三葉異黃酮，第8組為假手術(shù)組（sham）（表1）。試驗前5日實施去卵巢手術(shù)，12月18日空腹稱重、開始試驗，正試期60 d。

表1 試驗處理方案Table 1 Trial grouping and treatment program

1.3 試驗材料

試驗用岷山紅三葉異黃酮（以下簡稱紅三葉異黃酮）由岷州集團岷海制藥有限公司提取，總異黃酮含量10%，其中芒柄花素5.10%，鷹嘴豆芽素A 4.10%，大豆黃素0.05%，染料木素0.03%；經(jīng)急性毒性試驗，未見紅三葉異黃酮有明顯的急性毒性反應(yīng)。

1.4 試驗方法

1.4.1 大鼠去卵巢方法 用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠（劑量按45 mg／kg BW計）后，沿腹中線切口（長約1 cm），切除兩側(cè)卵巢。

1.4.2 飼養(yǎng)方法 各組均飼以CL級大鼠專用顆粒飼料，日投料量按每100 g體重5 g計（5 g／100 g BW）；將各組大鼠分別置一籠中飼喂（群飼），日飼喂2次，自由采食和飲水。

1.4.3 投喂紅三葉異黃酮的途徑與方法 用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成濃度為32，16，8，4，2，和1 g／100 m L的紅三葉異黃酮懸液，分別給1～6組試驗大鼠灌胃，每日1次，灌服量為1 m L／100 g BW；7和8組每日1次灌服生理鹽水1 m L／100 g BW。

1.4.4 屠宰與取樣 試驗結(jié)束時，早晨空腹稱大鼠個體體重；腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，股動脈采血，其中1 m L加甘素抗凝，收集其余血液以3 000 r／min離心30 min，分離出血清置－20℃冰箱備用；分離子宮（雙側(cè)）、脾臟及胸腺，分別稱其重。

1.4.5 測定指標及測定方法 1）臟器指數(shù)

2）T－淋巴細胞轉(zhuǎn)化率采用形態(tài)學方法測定［17］。

3）血清抗氧化指標：總超氧化物歧化酶（T－SOD）采用黃嘌呤氧化酶法［18］；丙二醛（MDA）采用TBA法［19］；總膽固醇（CHO）采用酶比色法［20］；高密度脂蛋白膽固醇（HDL）采用磷鎢酸－Mg2＋沉淀法［20］；低密度脂蛋白膽固醇（LDL）采用聚乙烯硫酸鹽（PVS）沉淀法［21］。

T－SOD和MDA測定利用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒，CHO、HDL和LDL測定均采用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒，按說明書進行操作。

4）血清雌二醇（E2）：采用美國Adlitteram Diagnostic Laboratories，Inc生產(chǎn)的大鼠雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒，按說明書進行操作［22］。

1.5 統(tǒng)計分析

結(jié)果均以平均數(shù)±標準差示出。采用SPSS 13.0軟件的One－way過程對多數(shù)指標的數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，差異顯著時用Duncan氏法進行多重比較；對大鼠的體重變化用GLM Univeriate過程進行協(xié)方差分析，差異顯著時多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大鼠體重的影響

采用協(xié)方差分析，對大鼠試驗?zāi)┢骄w重及平均體增重進行校正（表2），結(jié)果顯示，假手術(shù)組（8）試驗?zāi)┢骄w重及平均體增重校正值均極顯著低于其他各處理（P＜0.01），去卵巢組（7）極顯著高于處理8及添加紅三葉異黃酮10～320 mg／（kg BW·d）的所有處理 （P＜0.01），此范圍內(nèi)紅三葉異黃酮添加量間無顯著差異（P＞0.05）。顯然，去卵巢明顯提高了試驗?zāi)w重與體增重，而按試驗方案添加不同劑量紅三葉異黃酮均使去卵巢大鼠兩指標提高的幅度減低，且劑量間無明顯差異。似乎可看出，機體自身的雌激素能明顯地控制體增重；添加紅三葉異黃酮10 mg／（kg BW·d）使去卵巢大鼠的體增重下降，提高添加量并未使該指標產(chǎn)生變化，但紅三葉異黃酮影響體增重的作用低于大鼠卵巢雌激素。

表2 各處理大鼠試驗期平均體增重Table 2 Average weight gain of rats in the trial period for different treatment

2.2 對大鼠臟器指數(shù)及免疫功能的影響

處理8胸腺指數(shù)最低（表3），去卵巢處理（7）使該指標顯著提高（P＜0.05），給去卵巢大鼠添加10與80 mg／（kg BW·d）（P＜0.01）和20，40 mg／（kg BW·d）（P＜0.05）處理也顯著高于處理8，但均與處理7間無顯著差異（P＞0.05）；添加160與320 mg／（kg BW·d）（1，2）與處理8無顯著提高（P＞0.05），且較處理6顯著降低（P＜0.05），處理1顯著低于處理3（P＜0.05）。脾臟指數(shù)以假手術(shù)組最高，顯著高于處理2和6（P＜0.05），并有高于處理3，4和7的趨勢（P＝0.109 5，0.193 4和0.111 2），各添加組間及其與去卵巢組之間差異均不顯著（P＜0.05），說明紅三葉異黃酮對脾臟指數(shù)的影響不明顯。處理8子宮指數(shù)極顯著高于其他各組（P＜0.01），去卵巢與去卵巢添加不同量紅三葉異黃酮組間差異均不顯著（P＞0.05）；結(jié)果表明紅三葉異黃酮無提高子宮指數(shù)的作用，與卵巢雌激素截然不同。

處理7 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率顯著低于假手術(shù)組（8），處理4（P＜0.01）和1，2，3，5，6（P＜0.05）；各添加組之間及其與假手術(shù)組之間差異均不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，大鼠自身的雌激素在維持機體免疫功能方面有重要作用，添加紅三葉異黃酮10 mg／（kg BW·d）使T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率提高到假手術(shù)組的相近水平，而提高添加劑量并不能使該指標進一步提高。

表3 不同處理大鼠臟器指數(shù)及T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率Table 3 Change of internal organ indexes and T lymphocyte transformation rate of rats for different treatment

2.3 對血清抗氧化指標的影響

處理7血清CHO含量有高于處理8的趨勢（P＝0.088），表明去卵巢一定程度上使CHO提高；紅三葉異黃酮有降低CHO的作用，且有劑量反應(yīng)（處理6不太規(guī)律）；與去卵巢組（7）相比，處理1（P＜0.01），2和3的CHO較低 （P＝0.058和0.094）；處理5高于1（P＜0.05）和2（P＝0.085）；處理4和6也呈高于1的趨勢（P＝0.065和0.063）。處理7血清 HDL含量顯著高于8，1，2（P＜0.01）及3（P＜0.05）；處理5 HDL含量高于處理1和2（P＜0.01）及8和3（P＝0.051和0.063）；處理6和4均具有高于1和2的趨勢（P＝0.053，0.057）和（P＝0.072，0.079），各添加組及去卵巢大鼠血清 HDL含量存在線性關(guān)系（y＝－0.002 5x＋1.781；R2＝0.684，P＝0.022）。血清LDL變化與HDL相似，去卵巢組（7）極顯著高于8（P＜0.01），去卵巢后添加紅三葉異黃酮80（P＜0.01）與160，320 mg／（kg BW·d）（P＜0.05）才使LDL水平顯著低于7。血清CHO、HDL和LDL含量均以添加中、高劑量添加組的處理1，2和3較低。從絕對值看，似乎去卵巢組和10 mg／（kg BW·d）組血清MDA含量較高，但統(tǒng)計分析表明各處理間該指標差異均不顯著（P＞0.05），是否該指標較大的個體差異掩蓋了處理間差異，還有待進一步驗證。去卵巢使血清SOD含量下降，添加紅三葉異黃酮與去卵巢大鼠血清SOD含量存在曲線關(guān)系（y＝－1.8E－5x3＋0.008 5x2－0.792x＋164.67；R2＝0.810 5，P＝0.013）：在10～40 mg／（kg BW·d）范圍內(nèi)隨添加量增加逐漸下降，處理4和5（P＜0.05）顯著低于8；但在80～320 mg／（kg BW·d）范圍內(nèi)又漸次上升，最大添加量組顯著高于處理4和5（P＜0.05），且達到了假手術(shù)組的相近水平，處理2也顯示高于4的趨勢（P＝0.087）。

表4 不同處理血清抗氧化指標及E2含量變化Table 4 The serum antioxidation parameters and E2 level for different treatment

去卵巢組血清E2含量具有低于處理8的趨勢（P＝0.069）。從絕對值看各添加組血清E2含量介于二者之間，隨紅三葉異黃酮添加量的增加而上升，且存在線性關(guān)系（y＝0.010 6x＋12.704；R2＝0.896 9，P＝0.001），320 mg／（kg BW·d）組的測定值最接近假手術(shù)組，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），是否也與該指標個體測定值差異較大有關(guān)，有待進一步驗證。

3 討論

3.1 對大鼠體增重的影響

去卵巢能顯著提高雌性大鼠體重和全期平均體增重，添加10 mg／（kg BW·d）的紅三葉異黃酮即可使去卵巢大鼠兩項指標增幅下降，而進一步提高添加量并未使這兩項指標產(chǎn)生變化，未見明顯的量效關(guān)系，且紅三葉異黃酮影響體增重的作用僅達到大鼠卵巢雌激素的42.31%～51.78%。本試驗結(jié)果與前人研究揭示的異黃酮抑制雌性動物生長的規(guī)律相符合。張勇等［23］研究表明，紅三葉異黃酮對小鼠生長性能的影響與性別和劑量有關(guān)，對雌性小鼠的增重作用不顯著，且隨劑量增大有抑制作用，但可顯著提高雄性小鼠的生長性能，但隨劑量增大作用效果下降；任慧玲［24］的試驗也取得了類似結(jié)果；郭曉紅等［25，26］在肉仔雞上的試驗表明，大豆異黃酮的促生長作用對雄性動物較明顯而對雌性動物不明顯，試驗組仔母雞血清生長激素、胰島素樣生長因子（insulin－like growth factors，IGF－1）水平與對照組差異不明顯，而仔公雞血清GH、IGF－1及睪酮水平顯著升高；郭慧君等［27］的研究也表明，大豆異黃酮使去勢仔公豬的血清睪酮、IGF－I和血鈣水平顯著升高，但對去勢仔母豬卻表現(xiàn)為抑制作用，其血清睪酮和IGF－I含量下降。一般研究認為，異黃酮對雌性動物生長的抑制作用，可能與異黃酮的雌激素作用有關(guān)，雌激素使雌性動物促黃體激素（luteinizing hormone，LH）分泌下降，導(dǎo)致睪酮水平降低，使垂體GH的生成和釋放減少［26，28－30］。本試驗未呈現(xiàn)岷山紅三葉異黃酮抑制雌性大鼠生長的劑量效應(yīng)，與張勇等［23］的試驗報道不一致，可能與該異黃酮具有弱的雌激素活性有關(guān)，且其作用遠低于大鼠內(nèi)源雌激素。而對雄性動物的作用機理不同，紅三葉異黃酮等能與下丘腦、垂體等E2受體不同程度結(jié)合，影響動物神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的性軸，促進雄性動物睪酮的生成和釋放；同時，也影響生長軸，使垂體的GH生成和釋放增加，刺激肝臟GH受體發(fā)育和IGF－1生成加強，促進雄性動物生長［26，28－30］。

3.2 對大鼠免疫功能的影響

胸腺和脾臟是動物的重要免疫器官，胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的大小直接反映機體免疫水平的高低。一般認為，免疫器官重量降低為免疫抑制所致，而免疫器官重量增加則為免疫增強的表現(xiàn)［24，25，31］。結(jié)果顯示去卵巢能顯著提高大鼠胸腺指數(shù)，添加紅三葉異黃酮使其胸腺指數(shù)降低，當添加量≥160 mg／（kg BW·d）時，胸腺指數(shù)降低到與假手術(shù)組相近的水平，顯示高劑量外源植物雌激素與內(nèi)源雌激素一樣具有抑制胸腺細胞增殖的作用。去卵巢使大鼠脾臟指數(shù)降低，添加紅三葉異黃酮對其脾臟指數(shù)無明顯影響。去卵巢也使大鼠T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率降低，但添加紅三葉異黃酮10 mg／（kg BW·d）即可使T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率提高到與假手術(shù)組相近的水平，而提高添加劑量并不能使該指標進一步提高。這說明，低劑量紅三葉異黃酮即可提高大鼠的細胞免疫功能。朱宇旌等［32］在肉雞上的試驗表明，低劑量（基礎(chǔ)日糧中添加5 mg／kg）紅三葉異黃酮能提高肉雞免疫器官指數(shù)，當紅三葉異黃酮添加量進一步提高時，肉雞免疫器官相對重也表現(xiàn)出逐漸降低趨勢。朱宇旌等［31］對苜蓿異黃酮的研究認為，其對小鼠特異性和非特異性免疫功能都有一定的提高和改善，適宜添加量為120 mg／（kg BW·d）。任慧玲［24］研究認為，中、高劑量的苜蓿及紅三葉異黃酮能促進小鼠免疫器官的發(fā)育。劉德義［33］用奶牛試驗也表明，大豆黃酮60和70 mg／kg添加組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和T細胞數(shù)顯著高于對照組。有研究認為，植物雌激素具有免疫抑制和免疫刺激的雙重作用，低劑量雌激素可刺激淋巴細胞的增殖，而超生理劑量的雌激素抑制淋巴細胞增殖［34］。由此可見，不同來源的異黃酮對肉雞、小鼠、奶牛和大鼠等不同動物的免疫調(diào)節(jié)作用及有效劑量各不相同，可能與異黃酮來源及試驗動物種別有關(guān)，有待進一步研究和驗證。本試驗從紅三葉異黃酮提高大鼠免疫力和降低生產(chǎn)成本的角度來看，10 mg／（kg BW·d）添加量比較適宜。

3.3 對血清抗氧化指標及E2含量的影響

研究表明，異黃酮的酚羥基作為供氫體能與自由基反應(yīng)，使之形成相應(yīng)的離子或分子，熄滅自由基，終止自由基的鏈式反應(yīng)。異黃酮的抗氧化作用還表現(xiàn)在它們可減少活性氧自由基對DNA的損傷［33，35，36］。劉寶劍等［37］的體外試驗證明了紅三葉總黃酮清除自由基的作用，并且隨著異黃酮濃度的增加，對羥自由基的清除作用增強。SOD和谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH－Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）是生物機體內(nèi)重要的抗氧化酶，是重要的活性氧自由基清除劑［38］，有研究表明，大豆異黃酮能提高體內(nèi)抗氧化酶活性，用含300 mg／kg的染料木黃酮糖苷的高脂飼料喂養(yǎng)小鼠49 d，小鼠肝臟和心臟SOD和GSH－Px活性有不同程度地提高［39］，并可減少體內(nèi)MDA含量［40］，劉德義等［33］對奶牛的試驗中也得到了相似的結(jié)論。本試驗結(jié)果表明，紅三葉異黃酮具有降低血清CHO、LDL和HDL濃度，提高SOD活性，預(yù)防動脈粥樣硬化，抵抗自由基引起氧化損傷的作用。大鼠灌服一定劑量（＞80 mg／kg BW·d）的岷山紅三葉異黃酮，可降低血清CHO、LDL和HDL濃度；隨添加量增加，紅三葉異黃酮對血清SOD含量的影響存在先下降，后上升的曲線關(guān)系，最大添加量組血清SOD含量達到了假手術(shù)組的相近水平；血清MDA含量因較大的個體差異，各組間未呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義，但去卵巢組和10 mg／（kg BW·d）添加組血清MDA含量絕對值較高。同時還可看出，紅三葉異黃酮在降低血清CHO和LDL含量的同時，也使血清HDL含量降低，與相關(guān)試驗報道的大豆異黃酮上調(diào)血清HDL的作用［41］不一致，但與大豆黃酮在產(chǎn)蛋雞［42］，改構(gòu)異黃酮在大鼠［43］上的研究結(jié)果相符，是否也與試驗動物種別及異黃酮來源不同有關(guān)，需進一步驗證。

各添加組血清E2含量介于去卵巢組和假手術(shù)組之間，隨紅三葉異黃酮添加量的增加而上升，且存在線性關(guān)系（y＝0.010 6x＋12.704；R2＝0.896 9，P＝0.001），320 mg／（kg BW·d）添加組血清E2含量達到了假手術(shù)組相近的水平，顯示紅三葉異黃酮具有弱的雌激素樣作用，高劑量添加組也未出現(xiàn)血清E2含量高于假手術(shù)組的情況，說明其具有較好的使用安全性。李穎等［44］和陳琦等［45］試驗表明，紅三葉異黃酮在一定程度上具有提高去卵巢大鼠和圍絕經(jīng)期大鼠血清雌激素水平的作用。

4 結(jié)論

添加岷山紅三葉異黃酮對去卵巢雌性大鼠生長具有一定的抑制作用，但不存在量效關(guān)系；低劑量的紅三葉異黃酮具有提高大鼠 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的作用，以10 mg／（kg BW·d）的添加量比較適宜；適量（＞80 mg／kg BW·d）的紅三葉異黃酮可降低血清CHO、HDL和LDL濃度，升高血清SOD含量，具有明顯的抗氧化作用。本試驗未呈現(xiàn)紅三葉異黃酮上調(diào)血清HDL的作用；岷山紅三葉異黃酮具有弱的雌激素樣作用和較好的使用安全性；綜合各指標，岷山紅三葉異黃酮的適宜添加量為80 mg／（kg BW·d）。

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