于萬里，張博

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 新疆草地資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室（自治區(qū)重點(diǎn)）西部干旱荒漠區(qū)草地資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830052）

＊黃花苜蓿（Medicagofalcata）屬豆科苜蓿屬優(yōu)良牧草，分布于我國的西北、東北、華北等地，盡管其產(chǎn)量和再生性遜色于紫花苜蓿，但抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)能力強(qiáng)，具有耐寒、抗旱、耐鹽堿、耐風(fēng)沙、抗病蟲害等特性，是改良紫花苜蓿和抗性育種的重要種質(zhì)資源［1－3］。我國黃花苜蓿野生種質(zhì)資源豐富，尤其在新疆和內(nèi)蒙古等地，伊犁河谷昭蘇地區(qū)是黃花苜蓿資源較為豐富和集中的地區(qū)［4］。

目前，國內(nèi)對黃花苜蓿在栽培馴化、種子特性、組織培養(yǎng)、抗性機(jī)理、遺傳多樣性等方面均有研究。王俊杰［5］、于林清等［6］、蘇東等［7］對黃花苜蓿野生種群遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，黃花苜蓿野生種群內(nèi)和種群間均存在豐富的變異，黃迎新等［8］對引進(jìn)品種和錫盟野生黃花苜蓿的形態(tài)變異進(jìn)行了研究。王紅梅等［9］對二倍體和四倍體野生黃花苜蓿形態(tài)特征進(jìn)行了比較研究，營養(yǎng)器官的差異比生殖器官顯著。

種子是高等植物有性繁殖的主要方式之一，種子形態(tài)變異普遍存在于自然界種子植物中。研究表明，種群間、種群內(nèi)甚至個(gè)體間種子形態(tài)都有很大差異［10－13］。其形態(tài)特征受遺傳控制較強(qiáng)，受環(huán)境條件影響較小［14］。目前，國內(nèi)對黃花苜蓿莢果和種子形態(tài)變異的研究未見報(bào)道，以新疆昭蘇不同居群黃花苜蓿為研究對象，旨在揭示其莢果和種子表型遺傳變異規(guī)律及天然群體間親緣關(guān)系，以期為新疆黃花苜蓿遺傳多樣性研究及種質(zhì)資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料由新疆草地資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室的草種質(zhì)資源與育種研究室提供，2008年8月底采自新疆昭蘇地區(qū)，共8個(gè)群體（表1）。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)于2010年1－3月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。采用隨機(jī)抽樣法，每個(gè)群體隨機(jī)選取20個(gè)單株，測定莢果和種子的11個(gè)形態(tài)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)10次。

莢果形狀、莢果顏色、種子顏色等指標(biāo)采用數(shù)字編碼法。莢果形狀分3級，直線形為1、鐮刀形為2、半圓形為3；莢果顏色分4級，黃色為1、黃褐色為2、褐色為3、黑褐色為4；種子顏色分4級，黃色為1、黃褐色為2、褐色為3、咖啡色為4。

直線形莢果長即莢果中線的長度，鐮刀形和半圓形莢果利用細(xì)線繞著莢果彎曲，最后將細(xì)線拉直測得的長度即為莢果長度。莢果寬即莢果的最寬處。種子長、寬即種子的最長、最寬處。均用游標(biāo)卡尺測量，測量精度為±0.02 mm。

因野外采樣，種子量較少，種子重量采用百粒重表示，每個(gè)群體分單株取50粒種子，用萬分之一電子天平稱量。稱量精度為0.000 1 g。

剝離莢果，記錄每個(gè)莢果所含種子粒數(shù)。

表1 黃花苜蓿居群點(diǎn)采樣信息Table 1 The sampling site information of M.falcata

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0線性模型嵌套設(shè)計(jì)方差分析［15］，研究群體間和群體內(nèi)單株間2個(gè)水平上的差異。莢果和種子性狀觀測值的線性模型為：Y ijk＝μ＋Pi＋T j（i）＋eijk。其中，Y ijk為第i個(gè)群體第j個(gè)單株的第k個(gè)觀測值，μ為總均值；Pi為第i個(gè)群體的效應(yīng)值；T j（i）表示第i個(gè)群體內(nèi)的第j個(gè)單株的效應(yīng)值；eijk為試驗(yàn)誤差。

用主成分分析表型差異形成的主要原因，相關(guān)性分析各性狀之間以及與地理因子之間的相關(guān)關(guān)系，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用算術(shù)平均法（UPGMA）對不同群體進(jìn)行聚類分析，Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花苜蓿果實(shí)性狀的差異分析

試驗(yàn)結(jié)果顯示，莢果形狀多為直線型和鐮刀形；莢果顏色為黃褐色和褐色；種子形狀為腎形或近似腎形；顏色主要為黃色和黃褐色（圖1）。

結(jié)果表明，不同群體間，昭蘇地區(qū)黃花苜蓿除莢果長寬比性狀無顯著差異外，其他各性狀均有極顯著性差異。群體內(nèi)單株間除莢果寬、種子顏色和種子寬有顯著性差異外，其余均無顯著差異（表2）。通過群體間F值比較，莢果和種子的11個(gè)形態(tài)指標(biāo)中，百粒重的F值最大（25.581），其次為種子寬（23.178），種子長（18.639），莢果寬（10.674），莢果形狀（5.015），其他均小于5.0。群體內(nèi)F值種子寬最大（2.666），其次是種子顏色（2.032），莢果寬最?。?.969）。

昭蘇地區(qū)黃花苜蓿百粒重變異系數(shù)最大（0.540），百粒重最大為151.8 mg，最小為70.6 mg，兩者相差達(dá)81.2 mg，可能有二倍體黃花苜蓿。莢果形狀變異系數(shù)次之（0.535）。在群體內(nèi)，種子顏色變異系數(shù)最大，平均為0.554。平均每莢含種子數(shù)4.2粒（表3）。種子長、種子長寬比、種子寬等性狀變異系數(shù)較低，表明種子性狀具有較高的穩(wěn)定性，受較高的遺傳控制。

圖1 不同群體黃花苜蓿莢果和種子形態(tài)差異Fig.1 Morphological diversity of pod and seed of M.falcata in different populations

表2 黃花苜蓿莢果和種子形態(tài)差異分析Table 2 Variance analysis phenotypic characteristics of pod and seed of M.falcata

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 莢果和種子性狀間的相關(guān)性 通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析得出（表4）：莢果形狀與莢果顏色之間有極顯著正相關(guān)關(guān)系，表明隨著莢果彎曲度的增加，顏色逐漸加深；莢果長與莢果寬和含種子數(shù)之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，即莢果長度越長，相應(yīng)的寬度也較寬，含種子數(shù)多；莢果寬與種子長、種子寬、種子長寬比和百粒重之間有顯著相關(guān)關(guān)系，表明莢果越寬，則種子相應(yīng)地變長、變寬、重量增加，從相關(guān)系數(shù)可以看出，對種子的寬度影響較大，所以種子長寬比變小；莢果長寬比與種子長寬比二者也有極顯著正相關(guān)關(guān)系；種子顏色的深淺與每莢果含種子數(shù)之間有極顯著正相關(guān)關(guān)系，即含種子粒數(shù)較多的莢果，種子顏色較深；種子的長、寬與百粒重3個(gè)性狀之間有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度，呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，種子長與百粒重r＝0.98，種子寬與百粒重r＝0.94，表明種子長寬能反映重量的變化規(guī)律。

2.2.2 莢果和種子性狀與地理因子間的相關(guān)性 除莢果長度與海拔之間有相關(guān)關(guān)系外（表4），其他各性狀與地理因子之間均無相關(guān)性。莢果長與海拔的相關(guān)系數(shù)為0.71，表明隨著海拔的增加，莢果呈現(xiàn)逐漸變長的趨勢。

表3 各群體黃花苜蓿莢果和種子形態(tài)的變異Table 3 Morphological variation of pod and seed of M.falcata different populations

2.3 主成分分析

為探明影響黃花苜蓿不同群體間差異顯著的主要原因，對莢果和種子的10個(gè)性狀進(jìn)行主成分分析。前3個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率已達(dá)到72.903%（＞70%），它們可以代替原始因子所包含的主要信息（表5）。第1主成分的貢獻(xiàn)率為35.200%，對其作用最大的性狀主要為種子寬（0.949），百粒重（0.870），種子長（0.808）等，反映的是種子大??；第2主成分的貢獻(xiàn)率為21.994%，對其作用最大的性狀為莢果長／寬（0.924），含種子數(shù)（0.697），反映的是莢果含種子數(shù)；第3主成分的貢獻(xiàn)率為15.709%，對它作用最大的性狀是莢果顏色（0.593），莢果形狀（0.533），反映的是莢果的形狀（表5，6）。即群體間的差異主要來源于種子大小、莢果種子數(shù)和莢果形狀。

表4 黃花苜蓿莢果、種子形態(tài)及地理位置間的相關(guān)系數(shù)Table 4 Correlation coefficient among morphological trait and between morphological traits and geological factors

2.4 聚類分析

對果實(shí)10個(gè)形態(tài)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后，采用UPGMA對8個(gè)群體黃花苜蓿進(jìn)行聚類分析，在歐式距離3.64處可將8個(gè)群體聚為4類（圖2），其中ZMY單獨(dú)為一類，該地區(qū)距其他群體較遠(yuǎn)，海拔最高，莢果大，每莢果種子粒數(shù)較多，可表述為“大莢果型”；ZMK、ZSK聚為一類，其主要特點(diǎn)是種子長、種子寬、百粒重?cái)?shù)值最大，可表述為“大粒型”；ZM單獨(dú)為一類，種子短小、百粒重小，可表述為“小粒型”；ZSL、ZSM、ZSJ、ZSS聚為一類，可表述為“中間型”。

3 討論

黃花苜蓿作為野生種質(zhì)資源，具有抗逆性強(qiáng)和適應(yīng)性廣的特點(diǎn)，國內(nèi)外的研究主要集中于馴化、遺傳多樣性及優(yōu)異特性的開發(fā)利用上。形態(tài)多樣性是遺傳多樣性的基礎(chǔ)，也是檢測遺傳變異最簡便且有效的方法。但影響形態(tài)變異的因素除遺傳因素外，還有生境、形態(tài)特征及觀測次數(shù)的選擇不同和野外調(diào)查研究中取樣的局限性，一般選擇比較穩(wěn)定的形態(tài)指標(biāo)，如葉、莖、生殖器官等［16］。

表5 黃花苜蓿果實(shí)形態(tài)相關(guān)矩陣的特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalue，contribution rate and accumulative contribution rate of M.falcata

昭蘇地區(qū)8個(gè)不同生境條件下的野生黃花苜蓿群體，經(jīng)過長期的自然選擇和適應(yīng)，已產(chǎn)生明顯的分化，果實(shí)形態(tài)特征在群體間和群體內(nèi)均有豐富的遺傳變異［6］，表明黃花苜蓿有很強(qiáng)的適應(yīng)性。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)群體間的差異高于群體內(nèi)的差異，在野生大豆（Glycinesoja）的研究中也有類似的結(jié)果［17］，這與栽培品種差異主要來源于群體內(nèi)的研究結(jié)果相反［18］，表明野生種與栽培品種之間遺傳距離較遠(yuǎn)，遺傳改良的潛力巨大。因此，應(yīng)盡量采集較多的野生群體，為生物多樣性保護(hù)以及利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

黃花苜蓿莢果各性狀之間、莢果與種子性狀之間以及種子各性狀間都存在相關(guān)性，說明相關(guān)性狀可能在基因上存在著某種連鎖現(xiàn)象。隨著莢果彎曲度的增加，莢果顏色逐漸加深；莢果長度越長，相應(yīng)的寬度也較寬，含種子數(shù)增多；莢果越寬，則種子相應(yīng)地變長、變寬、重量增加；莢果含種子粒數(shù)較多的，種子顏色相應(yīng)較深，與百粒重?zé)o相關(guān)性，這與周刊社等［19］的研究結(jié)果相同；種子的長、寬與百粒重3個(gè)性狀之間有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)度，種子長寬能反映重量的變化規(guī)律，結(jié)果與何首烏（Polygonummultiflorum）的研究結(jié)果一致［20］。

地理阻隔和不同自然條件的長期作用可使果實(shí)和種子在植物居群間產(chǎn)生較大的差異。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，隨著海拔的增加，莢果呈現(xiàn)變長的趨勢，其他性狀與地理位置無相關(guān)性，即地理位置對黃花苜蓿果實(shí)性狀的遺傳變異影響較小。但通過黃花苜蓿生境地的考察以及聚類分析發(fā)現(xiàn)，ZMY地區(qū)海拔較高，距離人類活動(dòng)區(qū)較遠(yuǎn)，受人為干擾較少，在長期的自然條件下已形成獨(dú)特的大莢果型。ZSK、ZMK兩地區(qū)靠近公路，人類活動(dòng)頻繁，又相距較近，親緣關(guān)系較近，可能存在種質(zhì)滲透。ZM地區(qū)距其他群體較遠(yuǎn)，自然條件阻礙了基因間的交流，種子百粒重小，可能有二倍體黃花苜蓿［7］，需要進(jìn)一步通過核型分析驗(yàn)證。從果實(shí)形態(tài)來看，昭蘇地區(qū)黃花苜蓿的形態(tài)與地理位置有一定的關(guān)系，在麥冬（Ophiopogonjaponicus）和狗牙根（Cynodondactylon）的研究中有類似的結(jié)論［21，22］。因此，應(yīng)加強(qiáng)此地黃花苜蓿的種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用。

表6 黃花苜蓿果實(shí)性狀的主成分因子載荷矩陣Table 6 Component matrix among populations of M.falcata

圖2 基于莢果和種子形態(tài)特征的黃花苜蓿居群聚類圖（UPGMA）Fig.2 The clustering dendrogram of pod and seed morphological traits of M.falcata with Euclidean distance clustered

本研究只對新疆昭蘇地區(qū)野生黃花苜蓿果實(shí)形態(tài)進(jìn)行了初步的研究，研究的種質(zhì)資源取樣范圍較小，僅從莢果和種子的形態(tài)上很難完全揭示黃花苜蓿的遺傳及親緣關(guān)系。在今后的工作中應(yīng)加大取樣的范圍，選用更多的形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行研究，如葉、花等，并結(jié)合核型分析、分子標(biāo)記等手段來進(jìn)行，以選育優(yōu)良的黃花苜蓿種質(zhì)。

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