蘇秀華 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400） 鄭麗艷 （山東省嘉祥縣科學(xué)技術(shù)局）

?

豬偽狂犬病診斷檢測(cè)方法研究進(jìn)展

蘇秀華 張衍俊 （山東省嘉祥縣畜牧獸醫(yī)局 272400） 鄭麗艷 （山東省嘉祥縣科學(xué)技術(shù)局）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(PRV)引起，最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，因臨床表現(xiàn)與狂犬病類(lèi)似，故稱(chēng)偽狂犬病。該病在全球范圍內(nèi)的流行呈上升趨勢(shì)，世界上已有50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)導(dǎo)該病的流行。我國(guó)自1947年劉永純從豬體分離到PRV以來(lái)，已有24個(gè)省(市)、自治區(qū)報(bào)導(dǎo)流行。本文主要對(duì)血清學(xué)、分子生物學(xué)診斷與檢測(cè)方法，以及鑒別診斷方法進(jìn)行了綜述。

1 臨床診斷和病理組織學(xué)檢測(cè)

成年豬無(wú)明顯癥狀，母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀，肌肉震顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá)41~42℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他大體剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出A型核內(nèi)包涵體。

2 病原學(xué)診斷技術(shù)

此種方法也被稱(chēng)為診斷PRV的黃金標(biāo)準(zhǔn)。病毒分離時(shí)可以采集病豬的組織有：腎臟、腦、肝、脾及扁桃體，勻漿后加上雙抗，接種到敏感細(xì)胞，直至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變(CPE)。這種方法的敏感性較差[1]。

3 核酸探針檢測(cè)技術(shù)

探針技術(shù)由于其具有特異性良好、敏感程度高的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于PRV的診斷和檢測(cè)中。Rirtle等首次使用核酸探針技術(shù)鑒定了野外分離的PRV，從而獲得了流行病學(xué)的研究資料。其后，用生物素和地高辛標(biāo)記的探針從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出PRV DNA，并進(jìn)行了原位雜交，從單細(xì)胞的水平上檢出存在的潛伏感染。國(guó)內(nèi)也存在利用探針檢測(cè)技術(shù)的研究，采用32P探針標(biāo)記PRV全基因組和重組質(zhì)粒應(yīng)用斑點(diǎn)雜交技術(shù)，從而獲取培養(yǎng)物中的PRV存在的信息，能檢測(cè)出10pg的PRV–DNA，并具有較高的特異性[2]。

4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)

4.1 常規(guī)PCR 目前，主要根據(jù)病毒生存必須的糖蛋白基因和毒力基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，檢測(cè)的基因片段主要有g(shù)B、gD、gG和gE等，其中g(shù)D基因是該病毒的主要中和抗原基因。如Echeverria M G等以PRVgD基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)了一對(duì)引物，利用PCR法對(duì)19頭豬的組織樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明有15頭PCR反應(yīng)陽(yáng)性，而病毒分離只得到了3株P(guān)RV。周復(fù)春等應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行了PRV的檢測(cè)，并對(duì)潛伏的感染部位也進(jìn)行了相應(yīng)的研究。其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%[3]。石建平等對(duì)常規(guī)PCR法進(jìn)行了改進(jìn)，提高PCR的效率，使PCR技術(shù)更趨于實(shí)用化，根據(jù)gD基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，選用高速離心和短時(shí)間100℃水浴釋放模板，將試驗(yàn)縮短到4h內(nèi)完成[4]。陳本龍等(2009)根據(jù)gD基因設(shè)計(jì)引物，成功建立了檢測(cè)PRV的PCR體系[5]。

4.2 鑒別PCR Katz(1992)根據(jù)gE、TK基因設(shè)計(jì)的套式PCR能將PRV野毒株和不同疫苗株有效地鑒別開(kāi)[6]。劉麗娜等設(shè)計(jì)了與PRV的gB、gD、gE基因的3對(duì)引物，建立了能有效區(qū)分野毒株和基因缺失疫苗毒的多重PCR診斷方法，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，多重PCR可以檢測(cè)到106pg三基因缺失疫苗毒或756pg PRV野毒的核酸模板量[7]。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學(xué)調(diào)查和無(wú)本病健康豬群的建立，目前，國(guó)際上有各種商品化ELISA試劑盒出售。Mout (1978)[8]、Afshar(1987)[9]等分別建立了檢測(cè)偽狂犬病病毒抗體的間接ELISA方法。國(guó)內(nèi)蔣玉雯等(1988)[10]建立了檢測(cè)偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認(rèn)為ELISA敏感性高，且快速、簡(jiǎn)便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。王勇等用gE鑒別ELISA試劑盒調(diào)查某豬場(chǎng)流行情況，母豬陽(yáng)性率為81%，但缺點(diǎn)是此種方法費(fèi)用昂貴，難以在基層推廣[11]。

6 乳膠凝集實(shí)驗(yàn)技術(shù)(LA)

乳膠試驗(yàn)?zāi)夹g(shù)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。王澤州等于2001年報(bào)道利用此種方法對(duì)四川省的20個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了血清檢測(cè)，陽(yáng)性率為14.7%，少數(shù)豬場(chǎng)陽(yáng)性率達(dá)到95%。羅勇等利用乳膠凝膠實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)疑似豬瘟病的病豬進(jìn)行了豬偽狂犬病毒的檢測(cè)，230份血清中陽(yáng)性率11%[12]。

7 血清中和實(shí)驗(yàn)技術(shù)(SNT)

SN是檢測(cè)病毒比較經(jīng)典的血清學(xué)方法，應(yīng)用比較方便，很多國(guó)家都采用此法檢測(cè)PRV。Boelaert(1999)應(yīng)用SN對(duì)比利時(shí)北部地區(qū)4個(gè)豬場(chǎng)的母豬進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，血清陽(yáng)性率分別為68%、60%、43%、18%[13]。李曉慧等采用SN和LAT兩種方法對(duì)吉林省8個(gè)地區(qū)1050份血清進(jìn)行了檢測(cè)，確定吉林省PR血清陽(yáng)性率為21.7%，兩種方法血清檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析準(zhǔn)確性差異不顯著[14]。邱德新等應(yīng)用血清中和實(shí)驗(yàn)(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價(jià)測(cè)定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)結(jié)果符合率高，特異性強(qiáng)，LAT比SNT敏感、快速簡(jiǎn)便和實(shí)用[15]。

8 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)

Gutekunst D E(1997)首次報(bào)道了利用微量瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢查豬血清中PRV抗體，由于AGID技術(shù)操作簡(jiǎn)單。結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，因此適用于基層獸研單位和大型豬場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)定性診斷及豬群隱性無(wú)感染的普查。吳斌等(1997)將AGID和SNT進(jìn)行了比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與SNT的陽(yáng)性符合率為94%，可以作為一種檢測(cè)偽狂犬病和抗體水平的檢測(cè)。代明娟等(2002)利用AGID技術(shù)對(duì)5個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行了抗體檢測(cè)，結(jié)果分析表明豬場(chǎng)的血清陽(yáng)性率為80.0%，再一次顯示了AGID技術(shù)的簡(jiǎn)便和快捷[16]。

9 結(jié)語(yǔ)

目前，可以用來(lái)診斷豬PRV的多種檢測(cè)手段中，傳統(tǒng)檢測(cè)手段可靠，但往往操作較復(fù)雜，或耗時(shí)較長(zhǎng)，實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難。血清學(xué)檢測(cè)手段，尤其是研制成功的部分ELISA試劑盒操作簡(jiǎn)單，方便，不需要使用昂貴復(fù)雜的儀器，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，特別是鑒別ELISA試劑盒可鑒別野毒感染和已免疫動(dòng)物，但一些ELISA方法還不夠完善。分子生物學(xué)方法特別是PCR技術(shù)，隨著研究的深入將更加趨于敏感、簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用。建立和完善用于我國(guó)的PR控制和消滅該病的診斷方法，是我國(guó)廣大獸醫(yī)科研工作者面臨的重大課題之一。

[1] 祁賢, 張婉華, 葉向陽(yáng). 豬偽狂犬病毒sl株分離鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技, 2002, 32(4): 24-26.

[2] 郭萬(wàn)柱, 劉亞剛, 婁高明. 獸醫(yī)病毒學(xué)[M]. 成都:四川科學(xué)技術(shù)出版社, 2003.

[3] 周復(fù)春, 陳煥春. 偽狂犬病病毒PCR檢測(cè)方法的建立[J1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000年增刊: 33.

[4] 石建平, 宣華, 盧強(qiáng)等. 偽狂犬病 PCR 檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 中國(guó)畜禽傳染病, 1996, 5: 16-20.

[5] 陳本龍, 張立懷, 王建華等. 豬偽狂犬病 PCR 檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2009(8): 310-311.

[6] Katz J B. Molecular analysis of pseudorabies virus vaccines and their rapid differentiation from wild type isolates using DNA amplified glycoprotein E and thymidine kinase gene segment polymorphism[ J]. Biological, 1992, 20: 187-195.

[7] 劉麗娜, 何啟蓋, 陳煥春等. 用多重 PCR 鑒別豬偽狂犬病野毒與疫苗毒的研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技, 2005, 35(2): 95-98.

[8] Mout F, Toma B, Fortier B. Appliaction of an enzyme-linked immunoassay for diagonosis of Aujeszky’s disease in swine. Vet Rec. 1978, 103(12): 264.

[9] Asfhar A, Wrihgt P F, Dulac G C. Evluation of an enzyme-linked immunoassay for detection of antibodies to Pseudorabies virus in porcine field sera. Can J Vet Res. 1987, 51: 539-541.

[10] 蔣玉雯, 黃國(guó)安, 馮軍. 應(yīng)用ELISA檢測(cè)豬的狂犬病病毒抗體[J]. 中國(guó)畜禽傳染病, 1988, 40(3): 35-36.

[11]王勇, 劉同賢, 王能力等. 豬偽狂犬病血清學(xué)診斷與防制[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2012, 7,55-56.

[12] 羅勇, 陳創(chuàng)夫, 王鵬燕等. 疑似豬瘟病料豬偽狂犬病的檢測(cè)[J].畜牧獸醫(yī)雜志, 2006,26(3).

[13] Belaert F. Prevalence of herds with young sows seropositive to pseudorabies in northern Belgium[ J]. Prev Vet Med, 1999, 41(4): 239-255.

[14] 李曉慧, 胡業(yè)平, 王為等. 吉林省豬偽狂犬病血清學(xué)調(diào)查[C]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第十次學(xué)術(shù)研討. 蘇州. 2003.

[15] 邱德新, 陳煥春, 何啟蓋等. 乳膠凝集試驗(yàn)與血清中和試驗(yàn)檢測(cè)豬偽狂犬病血清抗體的比較[J]. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 22(4): 302-305.

[16] 代明娟. 應(yīng)用瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)豬偽狂犬病[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2002, 5: 40.

（2012–10–11）

S858.28

A

1007-1733(2012)12-0095-02