葉敬禮 （江蘇省宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)業(yè)委員會 223800）

?

傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定

葉敬禮 （江蘇省宿遷市宿豫區(qū)農(nóng)業(yè)委員會 223800）

豬高熱綜合征是近年來由多種病原混合感染和繼發(fā)感染引起的一種以發(fā)熱、皮膚發(fā)紅、出現(xiàn)呼吸道和繁殖障礙等為主要特征的綜合征。其中胸膜肺炎放線桿菌(APP)是引起呼吸道癥狀并加大治療難度的重要病原之一。APP引起的豬傳染性胸膜肺炎，是一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)對豬高熱綜合征中胸膜肺炎放線桿菌的感染進(jìn)行了初步研究，分離鑒定了10株胸膜肺炎放線桿菌，為高熱綜合征的控制和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 2010年9月至2012年5月，從宿豫區(qū)發(fā)生高熱綜合征的56個(gè)豬場共采集豬病料142份，其中肺50份、關(guān)節(jié)液30份、心血40份、腦8份、脾臟6份、淋巴結(jié)5份和濃汁3份。

1.2 主要試劑及儀器 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。犢牛血清自制。胰蛋白大豆瓊脂(TSA)購自Difco公司。微量生化簽定試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均購自寶生物（大連）有限公司。凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀為Touchgene公司產(chǎn)品。

1.3 分離鑒定 （1）將病料接種于含NDA和血清的TSA固體培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)24~48h；挑取圓形、光滑濕潤、無色透明、直徑1~2mm的可以菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)。（2）將可以菌落的純培養(yǎng)物分別接種不含NAD和血清的TSA、不含NAD単含血清的TSA的平板，觀察菌落生長情況和形態(tài)大小。（3）將可疑菌落的純培養(yǎng)物接種生化鑒定管，生化鑒定管中同時(shí)加入5ml0.01%的NAD和5ml血清，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。（4）PCR鑒定：參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳凡碩士論文，根據(jù)APP apx IV(No.gi: 6671147)序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物為377bp大小的片段，引物由上海生工公司合成。上游引物5'-GCTCACGAACGTTT-GCTCAT-3'，下游引物5'-GGGGACGTAA CTCGGT-GATT-3'，反應(yīng)體系(50ml）：10×緩沖液50ml，2mmol/L dNTPs 1ml，10umol/ L/L上下游引物各1ml，滅菌ddH2O40ml。反應(yīng)條件：94℃ 1min，59℃1min，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)特性與鏡檢 在加有血清和NAD的TSA培養(yǎng)基上24h長成半透明菌落，針尖大小，直徑1~2mm,側(cè)對光線有虹光。在不含NAD和血清的TSA培養(yǎng)基、不含NAD但含血清的TSA培養(yǎng)基上均不能生長。表明分離的菌株具有NAD依賴性。在血小板上48h長成針尖大小的半透明菌落，多散在，少量短鏈狀或長鏈狀。

2.2 生化實(shí)驗(yàn) 生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離的可疑菌脲酶試驗(yàn)陽性，CAMP試驗(yàn)陽性，糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果為木糖陽性、葡萄糖陽性、甘露醇陽性、蔗糖陽性、阿拉伯糖陽性、乳糖陰性。

2.3 PCR鑒定 對上述經(jīng)鑒定的10株可疑菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)大小均與預(yù)期大小一致。

3 討論

本試驗(yàn)從大量臨床病料中分離到10株胸膜肺炎放線桿菌，分離率較低，究其原因，一是近年來呼吸道癥狀日益突出，病原復(fù)雜，胸膜肺炎放線桿菌的因素只是其一；二是胸膜肺炎放線桿菌較難分離；三是絕大部分臨床病料都是經(jīng)過抗生素治療，降低了分離效率。因此分離細(xì)菌性病原應(yīng)選取發(fā)病初期、癥狀典型且未經(jīng)抗生素治療的病例，并且使用合適的培養(yǎng)基、科學(xué)的分離鑒定方法，才能客觀真實(shí)地反映感染情況，提高分離效率。

（2012–11–11）

S853..61+2

B

1007-1733(2012)12-0105-02