孟 甜

（四川烹飪高等專科學(xué)校，四川 成都610100）

食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，其安全性直接關(guān)系到人類健康。微生物是影響食品安全最重要因素之一，食品中微生物種類、數(shù)量不僅決定食品貨架期，也是評價食品安全性的主要指標(biāo)[1]。食品法典委員會（CAC）將微生物性健康危害列為食源性危害的三大原因之一。特別是近年來，可導(dǎo)致人類感染的致病菌種類越來越多，病原微生物對人類的威脅越來越大[2]。如何快速、高效、準(zhǔn)確的檢測和評價食品中的微生物是全球研究的熱門問題。

1 傳統(tǒng)檢測方法

1.1 瓊脂平板培養(yǎng)法

1881年，Robertkoch首次引入瓊脂平板培養(yǎng)法用以檢測微生物[3]。后來隨著食品對微生物的要求，該法逐漸用于快速檢測微生物。

1.1.1 選擇性培養(yǎng)基檢測法

選擇性培養(yǎng)基是利用目的微生物對各種化學(xué)物質(zhì)敏感程度的差異，在培養(yǎng)基中加入選擇性抑制劑，用以抑制非目的微生物生長，使目的微生物生長的培養(yǎng)基。

啤酒企業(yè)所處環(huán)境不同其污染菌群不同，檢測啤酒污染菌使用的培養(yǎng)基也不同。使用NPS培養(yǎng)基可以較為準(zhǔn)確的檢測出啤酒中厭氧有害微生物的數(shù)量(主要為乳酸菌)。若樣品污染較為嚴(yán)重，使用NBB-A培養(yǎng)基也可比較準(zhǔn)確的檢測出結(jié)果。這兩種培養(yǎng)基因加入了啤酒酵母抑制劑，生產(chǎn)用酵母不能在其上面生長[4]。

1.1.2 顯色培養(yǎng)基檢測法

用顯色培養(yǎng)基快速鑒定微生物是一種相對較新的方法，該技術(shù)以生化反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過在培養(yǎng)基中加入細(xì)菌特異性酶的顯色底物直接根據(jù)菌落顏色對菌種作出鑒定，常用于食源性致病菌檢測[5]。如李斯特菌是一類個體較小的革蘭氏陽性桿菌，其中只有單增李斯特菌和綿羊李斯特菌具有致病性。近年來，許多國家致力于李斯特菌顯色培養(yǎng)基的研究，針對李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶和β-D葡萄糖苷酶設(shè)計顯色底物可對李斯特菌進(jìn)行快速檢測。

但顯色培養(yǎng)基檢測法也有一定缺陷，如檢測混合感染微生物時，常會造成目標(biāo)菌漏檢和檢測結(jié)果假陰性；對檢測結(jié)果不能定量分析等。

1.2 顯微鏡鏡檢法

顯微鏡鏡檢法是較常規(guī)的檢測法，一般觀察微生物形態(tài)和定量檢測。主要步驟是：（1）樣品的處理：使用顯微鏡檢測樣品中的微生物濃度要高，因此對于一般樣品而言，要先富集后鏡檢。（2）鏡檢：在潔凈的載玻片上滴一滴準(zhǔn)備好的菌液，蓋上蓋玻片，再滴一滴香柏油，使用油鏡檢測。

2 現(xiàn)代檢測方法

由于傳統(tǒng)的快速檢測方法存在諸多問題，為了能快速、方便、正確地檢驗食品微生物，近年來許多國家對此進(jìn)行研究，并取得了進(jìn)展，與傳統(tǒng)方法相比現(xiàn)代檢測方法更快、更方便、更靈敏[6]。

2.1 氣相色譜法

氣相色譜法是英國生物化學(xué)家諾貝爾獎金獲得者A.J.P.Martin等人1952年創(chuàng)立的一種新型分離分析方法。該法應(yīng)用于微生物檢測大約開始于20世紀(jì)50年代末，1963年Able等首次通過細(xì)胞脂肪酸的分析來進(jìn)行細(xì)菌分類，幾乎時Oyama 等又提出用裂解氣相色譜法鑒定細(xì)菌[7]。

將微生物細(xì)胞經(jīng)過水解、甲醇分解提取以及硅烷化、甲基化等衍生化處理后，使之分離盡可能多的化學(xué)組分供氣相色譜儀進(jìn)行分析[8]。不同的微生物所得到的色譜圖中，通常大多數(shù)峰是共性的，只有少數(shù)峰具有特征性，可被用來進(jìn)行微生物鑒定，分析檢測常見細(xì)菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 免疫學(xué)檢測方法

2.2.1 酶免疫檢測法

酶免疫檢測法（EIA）可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)是否需要分離結(jié)合和游離的酶標(biāo)記物分為均相和非均相兩種類型。非均相法較常用，包括液相免疫法與固相免疫法。固相免疫法的代表技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）[9]。

ELISA技術(shù)自20世紀(jì)70年代出現(xiàn)開始就成為檢驗中應(yīng)用最為廣泛的方法之一。它是將抗原或抗體吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測物質(zhì)含量。

ELISA技術(shù)具有可定量、反應(yīng)靈敏準(zhǔn)確、標(biāo)記物穩(wěn)定、用范圍寬、結(jié)果判斷客觀、簡便完全、檢測速度快以及費用低等特點，且同時可進(jìn)行上千份樣品的分析。

2.2.2 免疫層析技術(shù)

免疫層析（IC）是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的快速免疫分析技術(shù)，它將免疫學(xué)原理和層析原理結(jié)合，借助毛細(xì)管作用，樣品在條狀纖維制成的膜上泳動，其中的待測物與膜上一定區(qū)域的配體結(jié)合，通過酶促顯色反應(yīng)或直接使用著色標(biāo)記物，在短時間（20min內(nèi)）便可得到直觀結(jié)果。利用免疫層析原理開發(fā)出的各種食品微生物檢測試紙條具有很好的應(yīng)用價值。

2.2.3 免疫磁珠分離法

免疫磁珠分離法（IMS）是將磁性微球與免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來的方法。該方法是先用抗體包被的磁珠與樣品混合，再用一個磁場裝置收集磁珠。

該方法可快速的從食品成分中分離出靶細(xì)菌，克服了選擇性培養(yǎng)基的抑制作用問題。有報道稱用免疫磁性分離技術(shù)從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離出沙門氏菌。

2.2.4 免疫熒光法

免疫熒光法（IFT）是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

免疫熒光法主要有直接法和間接法。目前免疫熒光技術(shù)可用于沙門氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等的快速檢測。該技術(shù)的主要特點有特異性強、敏感性高速度快。

2.2.5 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗（LAT）是用人工大分子乳膠顆粒標(biāo)記抗體，使之與待測抗原發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)，以達(dá)到檢測目標(biāo)病原微生物或毒素的目的。如用于檢測食品中金黃色葡萄球菌的Aureus Tes試劑盒，該試劑的聚苯乙烯乳膠粒子中含有抗金黃色葡萄球菌A蛋白的IgG，當(dāng)含有金黃色葡萄球菌的樣品懸浮液加入含乳膠粒子的試劑后，A蛋白與IgG結(jié)合，凝聚酶和鞭毛抗原結(jié)合，lmin內(nèi)將產(chǎn)生凝聚反應(yīng)。

2.2.6 酶聯(lián)熒光免疫法

酶聯(lián)熒光免疫法（ELFIA）是在酶聯(lián)免疫吸附分析基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測方法。將酶系統(tǒng)與熒光免疫分析結(jié)合起來，在普通酶免疫分析的基礎(chǔ)上用理想的熒光底物代替生色底物，可提高分析的靈敏度和增寬測量范圍，減少試劑的用量。

目前，將酶放大技術(shù)、固相分離及熒光檢測三者聯(lián)合將會成為熒光免疫分析中最靈敏的方法。

2.2.7 免疫印跡法

免疫印跡（immunoblotting）法分三個步驟：第一，聚丙烯酞胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將蛋白質(zhì)抗原按分子大小和所帶電荷的不同分成不同的區(qū)帶。第二，電轉(zhuǎn)移，將凝膠中己分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第三，酶免疫定位，將前兩步中已分離，但肉眼不能見到的抗原帶顯示出來。

免疫印跡法綜合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特異性，是一種有效的分析手段廣泛應(yīng)用于酵母和真菌的檢測中。

2.3 傳感器檢測法

2.3.1 基因傳感器

基因傳感器是把已知核苷酸序列的半單鏈DNA分子固定在傳感器上（也稱ssDNA探針）和另一條互補ssDNA（目標(biāo)DNA）雜交，形成雙鏈DNA（dsDNA）后表現(xiàn)出一定的物理信號，再通過換能器反映出來?；騻鞲衅魇箤δ康腄NA測量時間大大縮短，且操作簡單、靈敏度高。

目前，基因傳感器主要有石英晶體振蕩器、光學(xué)式DNA傳感器等。Uramatsu等采用抗體壓電晶體生物傳感器測定大腸桿菌，檢測細(xì)菌下限為105個/mL。

2.3.2 生物傳感器

生物傳感器基本原理是通過被測分子與固定在生物接受器上的敏感材料發(fā)生特異性結(jié)合，并發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熱焓、離子強度、pH、顏色或質(zhì)量等變化信號，且反應(yīng)產(chǎn)生的信號強弱在一定條件下與特異性結(jié)合的被測分子含量存在一定數(shù)學(xué)關(guān)系，這些信號經(jīng)換能器轉(zhuǎn)變成電信號后被放大測定，從而間接測定被測分子的量[10]。它的特點是高特異性和高靈敏度。

有試驗已成功表明，采用光纖傳感器與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生物放大作用耦合，可實現(xiàn)對食品中李斯特菌單細(xì)胞基因的檢測，而采用酶免疫電流型生物傳感器可實現(xiàn)對存在于食品中少量的沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等的檢測。

2.4 分子生物學(xué)檢測法

2.4.1 PCR技術(shù)

PCR是l985年由美國Kary Mullis等人首創(chuàng)并由美國Cetus公司開發(fā)的一項體外擴(kuò)增DNA的方法[11]。利用PCR檢測細(xì)菌，以快速、靈敏的檢測樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，尤其是那些人工無法培養(yǎng)的細(xì)菌。

該方法已經(jīng)對乳酸菌、雙歧桿菌等進(jìn)行了精確的檢測和鑒定。用于檢測啤酒中淀粉酵母和啤酒酵母、水體中大腸桿菌和大腸菌群。另外，肉毒梭菌、沙門氏菌、變形弧菌、大腸桿等病菌都有用PCR方法檢測的報道。但是PCR技術(shù)的使用也有局限性，僅限于那些核酸序列已知的微生物的鑒定。

2.4.2 基因芯片

將各種基因寡核苷酸點樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上的寡核苷酸點雜交，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物。

Appelbaum在對幾種細(xì)菌進(jìn)行鑒別時，設(shè)計了一種鑒別診斷芯片，一方面從高度保守基因序列出發(fā)，即以各菌種間的差異序列為靶基因，另一方面選擇同種細(xì)菌不同血清型所特有的標(biāo)志基因為靶基因，固著于芯片表面，同時還含有細(xì)菌所共有的l6SrDNA保守序列以確定為細(xì)菌感染標(biāo)志，不僅敏感度高于傳統(tǒng)方法，且操作簡單，重復(fù)性好。

2.5 自動檢測法

美國麥道保健系統(tǒng)公司制造了稱作Vitek AMS的微生物自動檢測系統(tǒng)，該裝置最大特點在于無須經(jīng)過微生物分離培養(yǎng)和純化的過程，能直接從樣品中檢出特殊的微生物種類和菌群。麥道公司在原有Viteck AMS的基礎(chǔ)上，又推出第二代檢測系統(tǒng)，即Viteck免疫診斷檢測系統(tǒng)(ⅥDAS)。它是集固相吸附，酶聯(lián)免疫，熒光檢測和乳膠凝集試驗諸方法優(yōu)點于一體的綜合性檢測系統(tǒng)[12]。

2.6 抗阻測定法

在含有幾種不同底物的培養(yǎng)基上，分別接種適量的被檢微生物，經(jīng)培養(yǎng)后可用阻抗測量儀在檢測其生長情況的同時也表達(dá)出特征進(jìn)而鑒別其種、屬。此法廣泛用于細(xì)菌、酵母菌、霉菌和支原體等的檢測和鑒定，具有高敏感性、特異性、快反應(yīng)性和高度重復(fù)性等優(yōu)點。

2.7 “即用膠”測定法

“即用膠”測定法是把lml食物樣品傾入一盛有無菌液體培養(yǎng)基的試管中，混勻后再將混合物倒入一個裝有膠質(zhì)的特殊培養(yǎng)皿中?；旌衔锱c膠質(zhì)接觸后便形成瓊脂相似的復(fù)合物，經(jīng)培養(yǎng)后便可計數(shù)菌種及數(shù)量。該系統(tǒng)是包裝好的產(chǎn)品，用時不需滅菌，極適合野外測定。

2.8 自動旋轉(zhuǎn)平板測數(shù)法

通過螺旋制板機將0.035mL液態(tài)樣品以阿基米德螺線的形式接種在瓊脂平板上，輸樣量隨著輸液管從平板中心向邊緣的移動而減少。經(jīng)過培養(yǎng)后，將平板放在計數(shù)格上，此格劃分成一些已知面積的區(qū)間，菌落數(shù)即在此區(qū)間內(nèi)計數(shù)。此法已被AOAC推薦為法定方法，在美國廣泛采用[13]。

3 小結(jié)

隨著新型設(shè)備的使用如毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜法[14]，新型設(shè)備的聯(lián)用，如氣相色譜-原子吸收聯(lián)用，及新型方法的聯(lián)用如RT-PCR技術(shù)，不但能夠檢測到活性較強的細(xì)菌，而且還能夠檢測到處于VBNC狀態(tài)下的細(xì)菌，具有較強區(qū)分死活菌的能力，檢測結(jié)果可作為菌體活性評估的重要參照，這是其它快速檢測法以及傳統(tǒng)檢測法均無法比擬的優(yōu)勢[15]，將來的食品微生物檢測將更加快速、靈敏、簡便。

食品安全問題一直是引起人們廣泛關(guān)注的全球性問題之一，長期以來，科學(xué)家們都在尋求簡單、快捷、準(zhǔn)確的快速檢測方法，從傳統(tǒng)煩瑣費時的瓊脂平板培養(yǎng)法到現(xiàn)代方便、靈敏的各種免疫法、分子生物學(xué)及儀器聯(lián)用等方法，雖然有些技術(shù)方法還存在不完善、不足的地方，但是各國的專家都在致力于改善或?qū)で蟾涌茖W(xué)、更加完善的快速檢測技術(shù)[16]，相信隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步有更多新的技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)。不久將來食品微生物檢測技術(shù)一定能更好的服務(wù)于人類！

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