宋芳嬌 曾克武 王學(xué)美

中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，中藥成分復(fù)雜，多成分多靶點(diǎn)相互作用是其治病的主要機(jī)理。為了研究清楚中藥發(fā)揮作用的主要藥效成分，很多學(xué)者在中藥化學(xué)成分的分析和結(jié)構(gòu)鑒定等方面做了大量的研究。有效成分組的概念是在長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)和大量科學(xué)研究相結(jié)合的情況下提出來的。作為與臨床治療目的密切相關(guān)的所有藥理活性成分，有效成分組不僅是保證臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量檢測(cè)的重要對(duì)象，對(duì)中藥的質(zhì)量檢測(cè)和現(xiàn)代化進(jìn)程有重要意義。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)尤其是藥物分析技術(shù)和高通量篩選等技術(shù)的發(fā)展，中藥復(fù)方有效成分組的研究得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，并開拓了良好的前景。

1 中藥復(fù)方及其有效成分組概述

中藥復(fù)方是指在對(duì)疾病辨證論治的基礎(chǔ)上，按照配伍原則將兩味或兩味以上的藥材組成的一組藥物。中藥復(fù)方是按照君臣佐使、整體協(xié)同的原則進(jìn)行配制，各種藥效成分有機(jī)協(xié)同，相互配合達(dá)到治療效果，單獨(dú)某一活性成分并不一定有明顯的療效。中藥復(fù)方有效成分組是指中藥復(fù)方中與該復(fù)方臨床治療目的密切相關(guān)的所有有效物質(zhì)，是中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制的基本對(duì)象［1］。有效成分組的物質(zhì)來源復(fù)雜，包括原味藥材中的固有成分，不同制備過程的形成產(chǎn)物和經(jīng)體內(nèi)消化代謝產(chǎn)生的物質(zhì)［2］。目前由于中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，難以進(jìn)行藥物的質(zhì)量控制，制約了中藥復(fù)方的國際化和現(xiàn)代化進(jìn)程，因此中藥復(fù)方有效成分組學(xué)的研究具有重要意義。

有效成分組的概念有別于有效部位和有效成分。有效部位是指一味中藥或中藥復(fù)方中的一類或幾類化合物，其含量達(dá)到總提取物的50%以上并被認(rèn)為是治療疾病的有效成分，這一類或者幾類化合物的混合體即被認(rèn)為是有效部位。有效成分是指天然藥物中代表其功效的一種獨(dú)立的化學(xué)成分，一般具有明確的化學(xué)結(jié)構(gòu)式或物性常數(shù)。有效部位和有效成分都不能代表中藥復(fù)方中與治療目的密切相關(guān)的所有物質(zhì)，不能解釋有效成分組的整體作用，因而具有局限性。

2 中藥復(fù)方有效成分組研究方法

2.1 化合物群分析法

將復(fù)方作為一個(gè)整體，用現(xiàn)代分離技術(shù)將性質(zhì)相似的化合物群進(jìn)行分離，如分離成黃酮類、皂苷類、生物堿類，多糖類，所分離的化合物代表復(fù)方中所有藥物此種化合物的總和，再對(duì)各化合物進(jìn)一步分析，采用色譜，波譜等多種現(xiàn)代分析鑒定技術(shù)，確定化合物中的有效成分。劉斌等［3］對(duì)苦參湯生物堿部分進(jìn)行研究，首次從苦參湯中分離鑒定出8 種化合物，其中苦豆堿為首次在此復(fù)方中的苦參、生地黃、黃芩3 味中藥中發(fā)現(xiàn)。劉明生等［4］對(duì)傳統(tǒng)復(fù)方腸胃康進(jìn)行研究，利用多種柱色譜對(duì)復(fù)方進(jìn)行分離純化，再根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定出化合物結(jié)構(gòu)，首次從腸胃康有效成分組中分離出五種黃酮類化合物?；衔锶悍治龇ㄊ菑?fù)方有效成分組研究的基礎(chǔ)和重要手段，可明確有效成分組中化合物的結(jié)構(gòu)。

2．2 指紋圖譜分析

中藥指紋圖譜分析是一種綜合的、可量化的鑒定手段，是將某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定分析手段，得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖的分析方法。整體性和模糊性是指紋圖譜兩大基本屬性，更加符合中藥復(fù)方有效成分鑒定的特色，是順應(yīng)中藥復(fù)方發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生的一種質(zhì)量控制模式。中藥指紋圖譜需同時(shí)具有“共性”和“個(gè)性”兩種特性?！肮残浴睉?yīng)能體現(xiàn)出不同采收時(shí)期和不同產(chǎn)地的同一種藥材在某方面的共同特征;“個(gè)性”不僅要能反映出該種藥材有別于其他任何物質(zhì)的特點(diǎn)還要能體現(xiàn)出因產(chǎn)地和采收期不同而造成的差異［5］。中藥指紋圖譜有很多種建立方法:如薄層色譜法(TLC)，氣相色譜法(GC)，高效液相色譜法(HPLC)，高速逆流色譜法(HSCCC)，紫外可見光譜(UV)，紅外光譜(IR)和近紅外光譜(NIR)等。郭秋平等［6］用高效液相法測(cè)定11 批百合藥材的指紋圖譜，確立了13 個(gè)共有峰，該方法能較為全面的反映出百合的化學(xué)成分，為其質(zhì)量控制提供了有效參考。陳永剛等［7］以C18 色譜柱為分析柱，甲醇－水(含冰乙酸)為流動(dòng)相梯度洗脫，制備同一色譜條件下蕓香科柑橘屬6 種常用理氣中藥黃酮類成分的液相色譜指紋圖譜。此圖譜可以較為直觀的比較出各特征峰峰高及峰面積的差異。指紋圖譜分析推動(dòng)了復(fù)方有效成分組質(zhì)量檢測(cè)的極大發(fā)展。

但在實(shí)際應(yīng)用中，指紋圖譜分析還面臨著很多問題。比如制定標(biāo)準(zhǔn)圖譜時(shí)缺乏藥材來源，成藥工藝等各種指標(biāo)控制;在解決分離和檢測(cè)兩大問題方面，前沿新技術(shù)應(yīng)用不夠;實(shí)驗(yàn)室條件，儀器設(shè)備的不同會(huì)造成指紋圖譜有差異;大量信息的化學(xué)計(jì)量處理方法還不夠完善等。

2．3 藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究方法

中藥藥代動(dòng)力學(xué)是中藥藥理和藥物代謝動(dòng)力學(xué)相融合而成的一門邊緣學(xué)科，是中藥現(xiàn)代化的重要組成部分。很多學(xué)者在此方面做了大量的研究，采用不同的觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法研究中藥成分在體內(nèi)的代謝變化過程，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。藥代動(dòng)力學(xué)研究為復(fù)方有效成分組的體內(nèi)研究和安全使用奠定了基礎(chǔ)。

2．3．1 血藥濃度測(cè)定法

血藥濃度測(cè)定法是指在藥物吸收后，通過測(cè)定藥物中某一有效成分在血液中的濃度來計(jì)算藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)方法，主要適用于有效成分明確的中藥。該方法首先采集服藥動(dòng)物的血液，再用色譜法，免疫分析法或微生物法等測(cè)定方法檢測(cè)血液中某種有效成分的濃度，最后進(jìn)行參數(shù)計(jì)算，分析其藥動(dòng)學(xué)過程。曲靜偉等［8］利用熒光偏振免疫分析法指導(dǎo)臨床地高辛安全用藥。微生物法主要應(yīng)用于具有抑菌作用的中藥復(fù)方，潘嘉等［9］以抑菌效應(yīng)為測(cè)定指標(biāo)，得出川芎揮發(fā)油藥動(dòng)學(xué)過程屬于一室開放模型，為該復(fù)方抗炎有效成分組體內(nèi)代謝研究奠定了基礎(chǔ)。

2．3．2 藥理效應(yīng)法

藥理效應(yīng)法是以藥理效應(yīng)為測(cè)定指標(biāo)計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的方法。本方法優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)的藥理效應(yīng)與中藥功能主治一致，可以計(jì)算藥物整體藥效動(dòng)力學(xué)參數(shù)，符合中藥復(fù)方的整體觀念。五子衍宗方是經(jīng)典的中藥復(fù)方，具有補(bǔ)腎益精、疏利腎氣的作用，王學(xué)美等［10-11］在此方面做了大量臨床研究，發(fā)現(xiàn)此方不僅可改善內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)，還可降低AchE 活性，減少線粒體DNA 氧化損傷，改善輕度認(rèn)知障礙。這些研究不僅確定了該復(fù)方有效成分組的藥理效應(yīng)，還為該方以后進(jìn)一步的研究明確了方向。廖子君等［12］研究了中藥大黃的有效成分組中的大黃素，發(fā)現(xiàn)大黃素可顯著抑制人肺腺癌A-549 細(xì)胞的生長(zhǎng)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并且具有濃度依賴性。

藥理效應(yīng)法也有其局限性，由于中藥復(fù)方多靶點(diǎn)作用的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)過程中觀測(cè)指標(biāo)不同所得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異較大，再受到技術(shù)條件的限制，所得結(jié)論具有表觀性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中還存在種屬差異等問題。

2．3．3 毒理效應(yīng)法

毒理效應(yīng)法又稱藥物累積法，是以血藥濃度多點(diǎn)測(cè)定的檢測(cè)方法，用動(dòng)物急性死亡率代表藥物蓄積性的一種藥代動(dòng)力學(xué)研究方法，主要適用于有效成分和毒性成分相一致的中藥。具體操作方法是多組動(dòng)物按照不同的時(shí)間間隔給藥，求出不同時(shí)間點(diǎn)的體存百分率，再計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。肖鳳霞等［13］用此方法測(cè)定出四逆注射劑的毒性效應(yīng)在大鼠體內(nèi)成一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程。毒理效應(yīng)法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)指標(biāo)明確，但是不能應(yīng)用于人體，所以不是中藥藥動(dòng)學(xué)的發(fā)展方向。

2．3．4 血清藥理學(xué)(腦脊液藥理學(xué))

血清藥理學(xué)研究方法是給動(dòng)物經(jīng)消化道服用一定劑量的藥物，在合適的時(shí)間采血，制備含藥血清，以含藥血清取代原藥或原藥粗提取物作為藥物源進(jìn)行體外試驗(yàn)的藥理學(xué)研究方法。由于是體外試驗(yàn)，條件可控性強(qiáng)，可在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平上檢測(cè)藥物效應(yīng)和作用機(jī)理。血清為藥物源可避免粗制劑中的雜質(zhì)或鞣質(zhì)對(duì)體外細(xì)胞生存環(huán)境的影響，對(duì)中藥復(fù)方的研究有進(jìn)步意義。王寧寧等［14］用體外試驗(yàn)的方法，觀察含藥血清對(duì)癲癇大鼠離體海馬腦片的影響，揭示了中藥復(fù)方有效成分組的抗癲癇作用。王文萍等［15］用血清藥理學(xué)方法研究了中藥腸安泰體外對(duì)Co26lu 大腸癌細(xì)胞的抗癌作用。

隨著中藥血清藥理學(xué)的發(fā)展和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的需要，中藥復(fù)方的有效成分能否穿過血腦屏障并發(fā)揮對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用等問題越來越受到關(guān)注，中藥腦脊液藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。曾克武等［16］利用加味五子衍宗方含藥腦脊液研究了β 淀粉樣蛋白誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，得出復(fù)方中的黃酮類和多糖類成分可透過血腦屏障進(jìn)入腦脊液，并對(duì)神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用。陳艷艷等［17］以腦脊液藥理學(xué)為指導(dǎo)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)芳香開竅類中藥石菖蒲可能會(huì)降低星形膠質(zhì)細(xì)胞水通道-4 基因的表達(dá)。腦脊液藥理學(xué)為復(fù)方有效成分組的研究開辟了一條新的途徑。

但是，中藥血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法尚處在一種探索發(fā)展階段，其理論和實(shí)驗(yàn)操作方面都存在問題有待進(jìn)一步解決。首先被吸收入血的成分并不一定是有效成分，還可以是無效成分，甚至是毒性成分，所以不能確定含藥血清中發(fā)揮作用的就是有效成分。其次血清內(nèi)源性成分復(fù)雜，再加上藥物被吸收后某些微量成分與蛋白結(jié)合，給藥物監(jiān)測(cè)和藥理實(shí)驗(yàn)帶來了困難。在實(shí)驗(yàn)選材上，有待于規(guī)范動(dòng)物的年齡和種屬，不同年齡和種屬的動(dòng)物對(duì)藥物的吸收有差異，血清的藥物成分和含量也不盡相同。在實(shí)驗(yàn)操作上，要把握好給藥劑量和采血時(shí)間［18］。

2．4 高通量藥物篩選技術(shù)

高通量篩選技術(shù)是20 世紀(jì)80 年代后期發(fā)展起來的用于新藥研發(fā)的高新技術(shù)。高通量篩選可在分子水平和細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上通過自動(dòng)化和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)，同時(shí)對(duì)大量被篩選樣品進(jìn)行生物學(xué)和藥理學(xué)活性評(píng)價(jià)。利用高通量藥物篩選技術(shù)分析復(fù)方有效成分組的思路是:首先利用天然產(chǎn)物快速分離技術(shù)將中藥復(fù)方分離成接近單體化合物水平的幾百個(gè)甚至更多的成分，將經(jīng)過分離的這些樣品通過高通量篩選的多種藥物篩選模型便可以很快的了解各部分的藥效。再用現(xiàn)代色譜和色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，找出復(fù)方的有效成分，采用成方組合的方式進(jìn)行組合，形成有效成分組。最后用整體動(dòng)物模型作藥理作用評(píng)價(jià)和理論分析［19］。王月華等［20］用高通量篩選技術(shù)對(duì)中藥復(fù)方小續(xù)命湯的240 個(gè)連續(xù)組分的生物活性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L1 ～L40 和A100 ～A120 連續(xù)組分的抗氧化、抗損傷的作用效果好，可將這兩部分重新組合作為小續(xù)命湯的有效成分組，對(duì)復(fù)方進(jìn)行了精簡(jiǎn)優(yōu)化。高通量藥物篩選有可能得到治療效果更佳的理想藥物組分，為新藥研發(fā)提供思路。張冉等［21］建立α-葡萄糖苷酶抑制劑的高通量篩選模型，對(duì)30 味常用的清熱解表藥共72 個(gè)樣本進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)鴨跖草、山慈菇和桑葉的提取物可抑制α-葡萄糖苷酶，具有降血糖作用。

高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用克服了中藥復(fù)方傳統(tǒng)研究方法的技術(shù)障礙，實(shí)現(xiàn)了藥物篩選的自動(dòng)化和規(guī)?；?。但是此項(xiàng)技術(shù)在國內(nèi)起步較晚，尚處于發(fā)展階段。體外模型的篩選結(jié)果與整體藥理作用的關(guān)系，高通量篩選模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及新的藥物作用靶點(diǎn)的研究和發(fā)現(xiàn)等問題還有待進(jìn)一步解決。

2．5 其他方法

膜分離技術(shù)在制藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛，可有效去除懸浮物、蛋白、色素等大分子雜質(zhì)，在中藥的制備方面可取代醇沉，提取分離有效成分，特別是在提高中藥復(fù)方口服液質(zhì)量方面更突顯其優(yōu)勢(shì)［22］。近幾年，國內(nèi)外越來越關(guān)注胃腸道環(huán)境對(duì)藥物的最初影響，研究發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方在胃腸道內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化會(huì)影響有效成分的溶出，吸收和代謝。甘草酸是芍藥甘草湯中的有效配糖體成分之一，胃腸道菌群可將甘草酸代謝成活性產(chǎn)物甘草次酸，如果在臨床合用抗菌劑的話，會(huì)影響甘草酸的轉(zhuǎn)化，降低其生物利用度，何菊秀等［23］在此方面做出研究，指導(dǎo)臨床用藥。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)中藥的作用原理與其生物活性成分調(diào)控基因表達(dá)有關(guān)。劉小美等［24］研究2 型糖尿病大鼠胰島素受體底物-2 基因表達(dá)及復(fù)方黃連降糖片對(duì)其的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)其降糖原理可能與提高外周組織IRS-2 的基因表達(dá)，改善胰島素信號(hào)傳遞有關(guān)。類似的研究還有安胎養(yǎng)血合劑干預(yù)腎移植大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡及Fas/FasL 基因的表達(dá)［25］，益氣扶正藥干預(yù)脾虛大鼠腦內(nèi)IL-18 蛋白及基因表達(dá)等［26］。

中藥復(fù)方有效成分組研究方法優(yōu)缺點(diǎn)比較見表1。

3 展望

中藥復(fù)方有效成分組的研究已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但是其研究方法尚有待進(jìn)一步的改進(jìn)和提高，特別是以復(fù)方藥理作用機(jī)制為導(dǎo)向的有效成分組研究將是今后研究的重點(diǎn)。文中所述的各種中藥復(fù)方有效成分組研究方法各有利弊，如果能取長(zhǎng)補(bǔ)短，再加上各學(xué)科之間的交叉滲透，可以開創(chuàng)一個(gè)中醫(yī)藥研究和現(xiàn)代化的新模式，有助于促進(jìn)民族藥物的有效成分，作用機(jī)理和組方原理的闡明，并對(duì)中藥復(fù)方的臨床療效和質(zhì)量控制提供有益的借鑒，這將在中國新型藥物研發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。

表1 中藥復(fù)方有效成分組研究方法

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