董建英趙會蘭

（1云南麗江市人民醫(yī)院，云南 麗江 674100；2云南麗江市食品藥品檢驗所）

黃藤素片微生物限度檢查方法驗證研究

董建英1趙會蘭2

（1云南麗江市人民醫(yī)院，云南 麗江 674100；2云南麗江市食品藥品檢驗所）

目的：建立黃藤素片微生物限度檢查方法。方法：按《中國藥典》2005年版的規(guī)定，進(jìn)行該品種微生物限度檢查方法的驗證。結(jié)果：常規(guī)法試驗顯示黃藤素片對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有抗菌作用，不同批產(chǎn)品其抗菌活性有差異，回收率小于70%；培養(yǎng)基稀釋法可消除本品對上述4種菌株的抗菌作用，回收率大于70%；常規(guī)法試驗和稀釋法試驗均有1批未檢出大腸埃希菌；采用薄膜過濾法沖洗300或400 mL，檢出大腸埃希菌。結(jié)論：本品不能用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定，可采用稀釋法進(jìn)行測定；不能用常規(guī)法和稀釋法進(jìn)行控制菌檢驗，可采用薄膜過濾法進(jìn)行檢驗。

黃藤素片；微生物限度；方法驗證

黃藤素片是從防己科天仙藤植物黃藤中提取的生物堿精制而成。具有較強(qiáng)的殺滅金黃色葡萄球菌、抗酸性分枝桿菌的作用。臨床上主要用于婦科炎癥、菌痢、腸炎、呼吸道及泌尿道感染、外科感染等[1]，因此按常規(guī)法檢驗其微生物限度得到的結(jié)果不準(zhǔn)確，根據(jù)《中國藥典》2005年版的規(guī)定，必須采用方法學(xué)驗證試驗說明微生物限度檢查法結(jié)果準(zhǔn)確性和實驗方法的可靠性[2]。本研究對黃藤素片微生物限度的檢查方法進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示黃藤素片對枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌均有不同程度的抑制作用，不同批產(chǎn)品抗菌活性有差異[3]。

1 材料

1.1 樣品

黃藤素片，云南滇池制藥有限公司生產(chǎn)（規(guī)格：100片/瓶、100 mg/片；批號：060901、070301、070101）。

1.2 培養(yǎng)基及稀釋劑

營養(yǎng)瓊脂（批號：061102），玫瑰紅鈉瓊脂（批號：060221），膽鹽乳糖（批號：070117），營養(yǎng)肉湯（批號：081104），麥康凱瓊脂（批號：071225），改良馬丁培養(yǎng)基（批號：060315），北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；4-甲基傘形酮葡糖苷酸（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG）培養(yǎng)基（批號：060312），北京牛?；蚣夹g(shù)有限公司生產(chǎn)。無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH 7.0）

1.3 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44 102]、白色念珠菌 （Candida albicans）[CMCC（F）98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98 003]，均由云南省食品藥品檢驗所提供。本實驗所用大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌菌株為第3代，黑曲霉菌懸液為第2代。

2 方法

按照《中國藥典》2005年版（一部）微生物限度檢查法[4]附錄進(jìn)行。

2.1 菌液制備

2.1.1 取經(jīng) 37℃培養(yǎng) 18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 cfu/mL的菌懸液，備用。

2.1.2 取經(jīng)27℃ 培養(yǎng)18～24 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養(yǎng)物1 mL，用0.9%無菌氯化鈉溶液 10倍稀釋至約含 50～100 cfu/mL的菌懸液，備用。

2.1.3 取1 mL黑曲霉孢子懸液，用0.9%無菌氯化鈉溶液10倍稀釋至約含50～100 cfu/mL孢子懸液，備用。

2.2 供試液制備

稱取樣品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，為1∶10供試液。

2.3 常規(guī)法驗證試驗

2.3.1 試驗組取1∶10供試液1 mL和試驗菌50～100 cfu，然后每皿加15～20 mL營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，37℃培養(yǎng)48～72 h計數(shù)，進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定。

2.3.2 菌液組取試驗菌50～100 cfu，然后每皿加15～20 mL營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，37℃培養(yǎng)48～72 h計數(shù)。

2.3.3 供試品對照組取1∶10供試液1 mL，然后每皿加15～20 mL營養(yǎng)瓊脂或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，搖勻，37℃培養(yǎng)48～72 h計數(shù)。

表1 常規(guī)法試驗黃藤素片回收率結(jié)果

2.3.4 常規(guī)法試驗結(jié)果表明，本品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌有抗菌作用，不同批產(chǎn)品其抗菌活性有差異，回收率小于70%，故不能采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定。

2.4 培養(yǎng)基稀釋法驗證試驗

2.4.1 取 1∶10供試液采用 1.0、0.5、0.2 mL/皿再加入試驗菌50～100 cfu，方法同常規(guī)法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表2～4。

表2 第1次試驗黃藤素片回收率試驗結(jié)果

表3 第2次試驗黃藤素片回收率試驗結(jié)果

表4 第3次試驗黃藤素片回收率試驗結(jié)果

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基稀釋法可消除本品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抗菌作用，回收率大于70%，故可采用稀釋法（0.2 mL/皿）進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定。

2.5 常規(guī)法控制菌檢查方法驗證

2.5.1 試驗組取1∶10供試液10 mL和大腸埃希菌50～100 cfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基100 mL中，依據(jù)大腸埃希菌檢查法進(jìn)行試驗。

2.5.2 陰性對照組取1∶10供試液10 mL和金黃色葡萄球菌50～100 cfu，加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基100 mL中，依據(jù)大腸埃希菌檢查法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表5。

表5 控制菌檢查方法驗證結(jié)果

2.5.3 常規(guī)法試驗結(jié)果表明，有1批未檢出大腸埃希菌，故不能用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢驗。

2.6 稀釋法控制菌檢查方法驗證

2.6.1 取1∶10供試液10 mL和大腸埃希菌50～100 cfu，分別加入到膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基 100、200、300、400、500 mL中，依據(jù)大腸埃希菌檢查法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表6。

表6 稀釋法控制菌檢查方法驗證結(jié)果

2.6.2 稀釋法試驗結(jié)果表明，有1批未能檢出大腸埃希菌，故不能用稀釋法進(jìn)行控制菌檢驗。

2.7 薄膜過濾法控制菌檢查方法驗證

2.7.1 取1∶10供試液10 mL，注入開放式濾器（先用上述緩沖液潤濕濾膜），再用上述緩沖液100 mL分別沖洗3次或4次，總量300或400 mL，抽干，分別加入膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基100 mL和大腸埃希菌50～100 cfu，依據(jù)大腸埃希菌檢查法進(jìn)行試驗。結(jié)果見表7。

表7 薄膜過濾法控制菌檢查方法驗證結(jié)果

2.7.2 薄膜過濾法試驗結(jié)果表明，采用薄膜過濾法沖洗300或400 mL，檢出大腸埃希菌，可采用薄膜過濾法進(jìn)行控制菌檢驗。

3 討論

3.1 微生物限度方法學(xué)驗證是《中國藥典》2005年版新增項目。按照其規(guī)定，當(dāng)進(jìn)行藥品的微生物限度檢查法時，應(yīng)采用大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌 5株試驗菌逐一進(jìn)行回收率測定，以確認(rèn)所采用的方法適合該藥品的檢驗，驗證試驗應(yīng)包括對細(xì)菌、霉菌和酵母菌及控制菌的驗證。

3.2 黃藤素片對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有不同程度的抗菌作用，說明了《中國藥典》2005年版藥典規(guī)定進(jìn)行方法學(xué)驗證實驗是很必要的。

3.3 不同批號的黃藤素片用稀釋法進(jìn)行驗證試驗，其回收率試驗結(jié)果顯示，對大腸埃希菌的回收率差異較大，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的回收率無明顯差異，不同批號的黃藤素片進(jìn)行控制菌驗證試驗，對大腸埃希菌的抑制作用差異較大。可能與原藥材質(zhì)量和來源有關(guān)。3.4本品可采用稀釋法（0.2 mL/皿）進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)測定；采用薄膜過濾法進(jìn)行控制菌檢驗。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典1977年版（一部）[S].北京：人民衛(wèi)生出版社：523.

[2] 王德啟.珍珠冰硼散微生物限度檢查方法學(xué)驗證[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2011，8（2）：37-39.

[3] 蘇德模，馬緒榮.藥品微生學(xué)檢驗技術(shù)[M].北京：華齡出版社，2007：209-236.

[4] 國家藥典委員會.中國藥典2005年版（一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，附錄：70.

The Research on the Method Validation of Microbial Limit Test for Huangtengsu Tablets

Dong Jianying1，Zhao Huilan2(1 The People’s Hospital of Lijiang City of Yunnan Province，Yunnan Lijiang 674100，China；2 Institute for Foods and Drug Control of Lijiang City)

Objective：To establish the method of microbial limit tests for Huangtengsu tablets.Methods：According to the 2005 edition of the Chinese Pharmacopoeia，the microbiological test methods on Huangtengsu tablets were validated.Results：By using the conventional test methods，the antibacterial actions of Huangtengsu tablets were showed for escherichia coli，staphylococcus aureus，bacillus subtilis，and candida albicans，of which the antimicrobial activity varied with different product batches，and the recovery rate was less than 70%.The culture medium dilution method could eliminate the antibacterial activity of the product for the above four strains and the recovery rate was greater than 70%.Both conventional test methods and dilution method failed to detect escherichia coli in one batch of the product，which was improved by membrane filtration flushing with 300 or 400 mL.Conclusion：For the product，the dilution method can be used for the tests of bacteria (and mould or yeast)counts and membrane filtration can be used for bacteria detection rather than the conventional test methods.

Huangtengsu Tablets；Microbial Limits；Method Validation

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.05.008

2011-09-21）

董建英，女，副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：1327181629@qq.com趙會蘭，女，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗。通訊作者E-mail：1145472590@qq.com