李小川等

[摘要]目的：探討IL-32在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成過(guò)程中所起的生物學(xué)作用。方法：收集2009年10月至2011年6月廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織12例，增生性瘢痕組織12例，正常皮膚24 例，分別應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)IL-32在它們中的表達(dá)情況。結(jié)果：IL-32在正常皮膚增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達(dá)，在正常皮膚中表達(dá)較強(qiáng)，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)較弱；IL-32mRNA和IL-32蛋白在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表達(dá)較正常皮膚明顯降低（P均<0.05），而增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05）。結(jié)論：IL-32在病理性瘢痕組織的形成過(guò)程中起著一定的重要作用，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

[關(guān)鍵詞]IL-32；增生性瘢痕；瘢痕疙瘩

[中圖分類號(hào)]R619+.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）11-1991-03

病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕，迄今尚無(wú)很好的治療方法，是整形外科臨床面臨的棘手問(wèn)題之一。1992年Dahl等[1]發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子人白介素32 （interleukin-32， IL-32），2005年Kim SH等[2] 提出其有很多炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子的特性。近來(lái)研究證實(shí)其不但可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡過(guò)程中有重要的作用[3]，已經(jīng)成為腫瘤和結(jié)締組織疾病防治研究的重要對(duì)象[4]。病理性瘢痕包括瘢痕疙瘩與增生性瘢痕，瘢痕疙瘩具有腫瘤樣生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，且被認(rèn)為是一種免疫性、炎癥性疾病[5]。IL-32基因是否在病理性瘢痕的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起作用，據(jù)筆者所查文獻(xiàn)目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)檢測(cè)IL-32在病理性瘢痕組織的表達(dá)來(lái)初步揭示IL-32 在病理性瘢痕形成中所起的生物學(xué)作用，進(jìn)而從另一角度認(rèn)識(shí)病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制，可能從分子水平上為瘢痕防治提供新的思路。

1材料和方法

1.1 材料：2009年10月至2011年6月收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織標(biāo)本12例，其中男性5例，女性7例，年齡17～42歲，平均年齡29.5歲；增生性瘢痕組織標(biāo)本12例，其中男性4例，女性8例，年齡9～41歲，平均年齡25歲；正常皮膚標(biāo)本24 例，其中男性17例，女性7例。年齡10～45歲，平均年齡29歲。標(biāo)本取自先天性畸形、外傷、除皺術(shù)及包皮切除患者，取材部位為頭面、胸腹及四肢，瘢痕病變時(shí)間3～6個(gè)月。所有患者均無(wú)慢性疾病史，無(wú)長(zhǎng)期服用藥物病史，瘢痕未行局部藥物注射治療，并知情同意。

1.2 免疫組化檢測(cè)標(biāo)本中IL-32的表達(dá)：常規(guī)制備石蠟切片，干燥保存?zhèn)溆?。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)，SP）法，中性樹(shù)膠封片。每一批標(biāo)本均設(shè)已知陽(yáng)性對(duì)照和用PBS替代一抗的空白對(duì)照，染色結(jié)果的判斷以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽(yáng)性染色。按盲法原則分別獨(dú)立對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)：采用專業(yè)圖像分析軟件IPP6.0對(duì)IL-32蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量分析。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的累積光密度和所有細(xì)胞總面積，以每例5個(gè)視野的平均光密度作為該例的測(cè)量值，平均光密度=陽(yáng)性反應(yīng)的累積光密度/細(xì)胞總面積。

1.3 RT-PCR檢測(cè)IL-32mRNA表達(dá)

1.3.1 主要試劑： Trizol 總RNA提取試劑盒、SuperScriptTMIII First-Strand synthesis system for RT-PCR和普通瓊脂糖（大連寶生物工程公司），Pfu DNA Polymerase（Tiangen公司），100bp DNA marker（Santa cruz公司），焦碳酸己二酯（DEPC）、二甲基亞砜（DMSO）、核糖核酸酶A（RNase A）、溴化乙錠（EB）（Sigma公司）。

1.3.2RT- PCR測(cè)定

1.4 Western Blot檢測(cè)IL-32蛋白的表達(dá)：提取組織總蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品按0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl 加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS補(bǔ)足到20μl，每一濃度做三個(gè)復(fù)孔。測(cè)定A562，計(jì)算各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。取上述蛋白樣品各20μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；兩組間差異比較用t檢驗(yàn)，三組間差異比較用方差分析和q檢驗(yàn)。P>0.05差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果：IL-32在正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中均有表達(dá)（圖1～3），其中在正常皮膚中表達(dá)較強(qiáng)，在增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織中表達(dá)較弱，增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量與正常皮膚相比，其之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）（表1），表明IL-32蛋白的表達(dá)與瘢痕的增生有關(guān)。

2.2RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：IL-32mRNA的擴(kuò)增曲線、熔解曲線（圖4），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別比正常皮膚組明顯降低（P均<0.05）；增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2），表明病理性瘢痕中IL-32基因在mRNA水平與正常皮膚差異顯著。

2.3Western Blot檢測(cè)結(jié)果：電泳結(jié)果（圖5、6），可見(jiàn)增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白表達(dá)較正常皮膚明顯減少。增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別與正常皮膚相比，其之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），增生性瘢痕組和瘢痕疙瘩組的IL-32蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3），說(shuō)明病理性瘢痕中IL-32基因在蛋白表達(dá)水平與正常皮膚差異顯著。

3討論

目前研究發(fā)現(xiàn)IL-32的生物學(xué)功能如下：①誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[4]；②是重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡的基因，如T細(xì)胞中IL-32的大量表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]；③在自身免疫性/炎癥性疾病里起重要的作用[7-10]，如IL-32可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生且與多種炎癥性疾病密切相關(guān)，是一種前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，它與疾病的嚴(yán)重性程度有關(guān)，且在適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮作用。IL-32基因已被證實(shí)可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其是否與增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的發(fā)生有關(guān)，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)RT-PCR結(jié)果表明IL-32基因在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中表達(dá)與正常皮膚相比均明顯減弱（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明IL-32基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)異常。由此推測(cè)，在病理性瘢痕的形成過(guò)程中可能存在著IL-32基因的缺失、突變或不表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致瘢痕異常增生，提示了IL-32基因在病理性瘢痕的形成過(guò)程中起著重要的作用。

免疫組織化學(xué)研究結(jié)果表明： IL-32蛋白在正常皮膚組織中的表達(dá)最強(qiáng)，而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)均顯著低于正常皮膚中的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步明確在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中IL-32蛋白表達(dá)量分別與正常皮膚相比明顯減少（P均<0.05），表明IL-32基因在蛋白翻譯水平同樣發(fā)生異常。由此推斷， IL-32蛋白在病理性瘢痕中的表達(dá)減少可能是由于IL-32mRNA的表達(dá)減少而引起或與相關(guān)上游的調(diào)控蛋白表達(dá)異常有關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示IL-32是病理性瘢痕發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素之一，值得進(jìn)一步深入研究。

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[收稿日期]2012-09-21 [修回日期]2011-11-03

編輯/張惠娟