錢紅 趙亞 胡靜 閆英劍

[摘要]目的：研究大麻素II型受體（cannabinoid receptor II， CB2）在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)以及成骨分化中的作用。方法：體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，構(gòu)建細(xì)胞-機(jī)械牽張力加載模型，施加不同大小的機(jī)械牽張力，采用Real-time PCR和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)CB2在人牙周膜細(xì)胞中mRNA和蛋白的表達(dá)。用堿性磷酸酶（ALP）試劑盒檢測(cè)機(jī)械牽張力介導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性。結(jié)果：對(duì)人牙周膜細(xì)胞施加不同大小的機(jī)械牽張力24h，CB2 mRNA的表達(dá)隨機(jī)械牽張力的力值增大而顯著性增加（P<0.05），在18%拉伸應(yīng)變率作用下表達(dá)量最高（P<0.05），此時(shí)CB2蛋白的表達(dá)顯著增加。加入CB2激動(dòng)劑HU-308后，施加18%拉伸應(yīng)變率的機(jī)械牽張力作用于人牙周膜細(xì)胞24h，ALP活性顯著性增加（P<0.05）。結(jié)論：CB2在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)與機(jī)械牽張力的力值具有相關(guān)性。在機(jī)械牽張力作用下，大麻素受體CB2與其配體結(jié)合能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的成骨分化，從而在正畸牙槽骨改建中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]大麻素II型受體；機(jī)械牽張力；成骨分化；牙周膜細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）10-0-0

正畸治療中，矯治器所施加的機(jī)械力首先作用于牙齒，然后傳導(dǎo)至牙周膜，牙齒一側(cè)的牙周膜受到牽張力，牙槽骨形成；另一側(cè)牙周膜受到壓力，牙槽骨吸收，從而發(fā)生牙槽骨改建，使錯(cuò)位的牙齒在牙槽骨內(nèi)發(fā)生移動(dòng)，到達(dá)正常位置[1-2]。牙周膜細(xì)胞是機(jī)械力的直接效應(yīng)細(xì)胞，具有成骨樣細(xì)胞表型，受到機(jī)械牽張力作用后首先發(fā)生成骨分化，進(jìn)而形成牙槽骨，在正畸牙槽骨改建中發(fā)揮著極其重要的作用[3-4]。因此研究牙周膜細(xì)胞在機(jī)械牽張力作用下的成骨分化過程，對(duì)于深入了解正畸牙槽骨改建機(jī)制具有重要意義。但是，目前對(duì)于機(jī)械牽張力作用下牙周膜細(xì)胞發(fā)生成骨分化的機(jī)制仍未闡明。我們前期的研究證實(shí)：人牙周膜細(xì)胞表達(dá)大麻素II型受體（cannabinoid receptor II， CB2），CB2與其配體（CB2激動(dòng)劑）結(jié)合能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的成骨分化[5]，這提示我們：CB2很可能參與了機(jī)械牽張力作用下人牙周膜細(xì)胞的成骨分化過程。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究CB2在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基 （Hyclone，美國）；胎牛血清 （FBS，Gibco，美國）；胰蛋白酶 （Gibco，美國）；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG （Santa Cruz Biotechnology， 美國）；HU-308（Cayman Chemical， 美國）； SR144528（Cayman Chemical， 美國）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒 （南京建成生物制品公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 （Forma Scientific，美國）；YJ-875型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡及照像系統(tǒng) （Olympus，日本）；Flexercell Strain Unit （Flexcell International，美國）；ABI 7500 Fast Real-time PCR System （Applied Biosystems， 美國）。

1.2人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定：取11～14歲青少年因正畸拔除的牙周健康的雙尖牙。采用組織塊法原代培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，取第2代細(xì)胞爬片，用免疫組化SP法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白染色，進(jìn)行來源鑒定。證明細(xì)胞為間葉來源后，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3人牙周膜細(xì)胞的體外加力：采用細(xì)胞機(jī)械牽張力加載裝置Flexercell Strain Unit，構(gòu)建人牙周膜細(xì)胞-力學(xué)加載模型。對(duì)細(xì)胞加載24h的機(jī)械牽張力，力值分別為0%、6%、12%、18% 拉伸應(yīng)變率，頻率為6循環(huán) / min，每循環(huán)包括5s拉伸，5s松弛。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)機(jī)械牽張力作用下CB2 mRNA在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)

1.4.1 總RNA提?。涸趶椥耘囵B(yǎng)皿中加入lml Trizol，吹散，收集細(xì)胞于1.5ml Ep管內(nèi)，震蕩30s后加入0.2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)30s，室溫3min，12 000g，4℃離心，l5min，吸上層無色水相，移入另一EP管中（約0.5ml）。加等體積異丙醇，-20℃，30min。12 000×g，4℃ 離心，10min。在管底部可見微量RNA 沉淀。棄上清，加75%乙醇lml，振蕩。7 500×g，4℃ 離心，10min。棄上清，用濾紙吸取殘留液體，室溫干燥 5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水，測(cè)OD260/OD280計(jì)算濃度與純度，-70℃保存。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4.2 Real-time PCR實(shí)驗(yàn)：引物設(shè)計(jì)見表1，Real-time PCR 根據(jù)QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒手冊(cè)進(jìn)行。反應(yīng)混合液（25L）預(yù)先在95℃放置l5min以激活熱啟動(dòng)Taq酶，然后95℃變性30s，95℃退火5s，60℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。其中內(nèi)參l8s-rRNA同樣進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。采用△ △Ct方法計(jì)算每個(gè)樣品目的基因與內(nèi)參的比值作為目的基因的mRNA表達(dá)。

1.5 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)機(jī)械牽張力作用下CB2 蛋白在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)：將長(zhǎng)有細(xì)胞的玻片放于玻璃器皿內(nèi)，冷丙酮固定，0.5%Triton-X 100的PBS透化，正常山羊血清封閉，滴加用抗體稀釋液稀釋的兔抗人CB2一抗（1：100），濕盒中4℃過夜，漂洗后滴加用FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1：500），暗室中在室溫孵育30～60 mim，PBS徹底漂洗，90%甘油封片。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 用ALP試劑盒檢測(cè)加入CB2激動(dòng)劑HU-308和/或CB2抑制劑SR144528后，機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞ALP活性：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，2.5g/L 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/ FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔103細(xì)胞接種到96孔板上，每孔體積為200μl，次日去除未貼壁死細(xì)胞，換含10ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，分別加入10-7M CB2激動(dòng)劑HU-308和/或1μM CB2抑制劑SR144528，然后施加18%拉伸應(yīng)變率的機(jī)械牽張力24h，采用ALP試劑盒檢測(cè)ALP活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1 CB2 mRNA在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)：Real-time PCR結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，施加不同大小的機(jī)械牽張力作用于人牙周膜細(xì)胞24h，CB2 mRNA的表達(dá)隨機(jī)械牽張力的力值增大而顯著性增加（P<0.05），在18%拉伸應(yīng)變率作用下表達(dá)量最高（P<0.05）。

2.2 CB2 蛋白在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)：細(xì)胞免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，施加18%拉伸應(yīng)變率的機(jī)械牽張力作用于人牙周膜細(xì)胞24h，CB2 蛋白的表達(dá)顯著增加。

3.3 機(jī)械牽張力作用下，人牙周膜細(xì)胞ALP活性：如圖3所示，加入CB2激動(dòng)劑HU-308后，施加18%拉伸應(yīng)變率的機(jī)械牽張力作用人牙周膜細(xì)胞24h， ALP活性顯著性增高（P<0.05）；然后再加入CB2抑制劑SR144528，ALP活性顯著性降低（P<0.05）。

3討論

內(nèi)源性大麻素（canabinoid，CB）系統(tǒng)包括大麻素受體、其內(nèi)源性配體以及大麻素合成、降解酶。生物體內(nèi)存在大麻素I型受體（cannabinoid receptor I，CB1）和大麻素II型受體CB2，這兩型大麻素受體都屬于G蛋白耦聯(lián)受體。CB1主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，包括大腦與脊髓；而CB2主要分布于外周[6]。近幾年來骨代謝研究領(lǐng)域最重要的發(fā)現(xiàn)之一是證實(shí)骨組織內(nèi)存在著內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)。CB2與其配體（CB2激動(dòng)劑）結(jié)合通過以下機(jī)制維持骨量：①直接促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及功能表達(dá)；②直接抑制破骨細(xì)胞分化及功能表達(dá)，或通過抑制成骨細(xì)胞表達(dá)的破骨細(xì)胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）來間接抑制破骨細(xì)胞[7]。

我們前期的研究結(jié)果證實(shí)：人牙周膜細(xì)胞表達(dá)大麻素受體CB2。CB2與其配體結(jié)合能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞成骨標(biāo)志物的表達(dá)，從而證明： CB2能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的成骨分化[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了機(jī)械牽張力對(duì)CB2在人牙周膜細(xì)胞中表達(dá)的影響以及CB2在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的人牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：CB2在人牙周膜細(xì)胞中的表達(dá)與機(jī)械牽張力的力值具有相關(guān)性。這說明CB2是一種對(duì)機(jī)械牽張力敏感的基因，那么它在機(jī)械牽張力介導(dǎo)的牙槽骨改建中究竟發(fā)揮什么作用？進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在機(jī)械牽張力作用下，CB2與其配體（CB2激動(dòng)劑）結(jié)合能夠增加ALP活性。ALP廣泛分布于體內(nèi)幾乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通過水解磷酸酯、破壞礦化抑制劑及作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基的轉(zhuǎn)運(yùn)子而促進(jìn)礦化。作為生物礦化和成骨樣細(xì)胞的一種特征性標(biāo)記，其活性的高低可反映相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向分化的趨勢(shì)。以往的研究發(fā)現(xiàn)：人牙周膜細(xì)胞在機(jī)械牽張力作用下ALP活性升高，成骨標(biāo)志物表達(dá)增加[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：在機(jī)械牽張力作用下，CB2與其配體結(jié)合能夠促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的成骨分化，從而在正畸牙槽骨改建中發(fā)揮重要作用。目前國內(nèi)外的研究?jī)H限于大麻素系統(tǒng)對(duì)骨代謝的調(diào)控作用和牙周炎時(shí)促進(jìn)牙周組織愈合的作用[7-10]，關(guān)于CB2在機(jī)械牽張力作用下人牙周膜細(xì)胞成骨分化中的作用尚未見報(bào)道。我們將繼續(xù)深入地進(jìn)行研究，以期為完善正畸臨床理論以及相關(guān)骨生物力學(xué)理論作出貢獻(xiàn)。

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[收稿日期]2012-08-25[修回日期]2012-09-21

編輯/張惠娟