馬玉花 楊春江 宋維秀 等

摘要：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對西寧地區(qū)的９種忍冬屬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．）植物葉片的過氧化物酶（ＰＯＤ）同工酶酶譜進(jìn)行研究，結(jié)果表明，９種植物的ＰＯＤ同工酶電泳共出現(xiàn)８條酶帶。其中ＰＯＤ－１為試驗(yàn)植物材料共有的酶帶，ＰＯＤ－２僅在蘭果忍冬中出現(xiàn)，ＰＯＤ－３僅在紅脈忍冬中出現(xiàn)，因而ＰＯＤ－2和ＰＯＤ－3可作為上述兩種植物的分類鑒定依據(jù)。聚類分析結(jié)果將９種忍冬屬植物分成３大類，分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：忍冬屬植物；葉片；過氧化物酶同工酶

中圖分類號：Ｑ９４９．７８１．２ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）15－3246-03

Study on Peroxidase Isozyme Pattern of Leaves of Nine Lonicera Species

ＭＡ Ｙｕ－ｈｕａ，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｊｉａｎｇ，ＳＯＮＧ Ｗｅｉ－ｘｉｕ，ＳＨＥＮＧ Ｎｉｎｇ－ｄｏｎｇ，ＭＡＯ Ｋａｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ leaves of ｎｉｎｅ Ｌｏｎｉｃｅｒａ Species ｉｎ Ｎａｎｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ８ ｂａｎｄｓ ｏｆ ＰＯＤ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｉｎ ｎｉｎｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ＰＯＤ－１ appeared ｉｎ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ， ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ considered ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．； ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ＰＯＤ－２ ａｎｄ ＰＯＤ－３ ｏｎｌｙ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ Ｌ． ｃａｅｒｕｌｅａ Ｌｉｎｎ．， Ｌ． ｔｒａｇｏｐｈｙｌｌａ Ｈｅｍｓｌ respectively， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｂｅ considered ａｓ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ． Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ at ｔｈｅ Ｊａｃｃａｒｄ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ０．６０， ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ could ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Lonicera L.； POD isozyme； leaves

忍冬屬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ Ｌ．）是忍冬科（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）中的一個(gè)重要屬，全世界約有忍冬屬植物２００種，我國有９８種［１］，青海省有忍冬屬植物１９種６變種１變型［２］。忍冬屬植物是優(yōu)良的園林綠化樹種，也是重要的藥用植物，因而對忍冬屬植物栽培種及原生種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和分類，是進(jìn)一步做好忍冬推廣應(yīng)用的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作。目前，常規(guī)的形態(tài)手段進(jìn)行分類鑒定的研究結(jié)果在界定忍冬屬植物親緣關(guān)系時(shí)結(jié)論差異很大，因而給忍冬屬植物的品種鑒定、良種選育及推廣帶來很大困難。

同工酶在進(jìn)化中具有一定的保守性，受基因控制，在一定程度上能夠反映生物的系統(tǒng)發(fā)生［３］。因此，通過同工酶酶譜分析可以為植物分類和系統(tǒng)學(xué)提供依據(jù)［４，５］。目前，關(guān)于忍冬屬植物的同工酶酶譜分析只有關(guān)于金銀花同工酶酶譜分析的報(bào)道［６］，而通過同工酶酶譜分析對青海省分布或廣泛引種栽培的忍冬屬植物的分類研究鮮見報(bào)道。通過對青海廣泛引種栽培的９種忍冬屬植物的葉片ＰＯＤ同工酶酶譜進(jìn)行比較分析，以期為忍冬屬植物的開發(fā)利用及親緣關(guān)系的鑒定提供依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

試驗(yàn)的９種忍冬屬植物分別為紅脈忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｎｅｒｖｏｓａ Ｍａｘｉｍ）、華西忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｗｅｂｂｉａｎａ）、蘭果忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｅｄｕｌｉｓ）、隴塞忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔａｎｇｕｔｉｃａ Ｍａｘｉｍ）、金花忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈａ Ｔｕｒｃｚ）、金銀木（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａａｃｋｉｉ Ｍａｘｉｍ）、盤葉忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔｒａｇｏｐｈｙｌｌａ Ｈｅｍｓｌ）、小葉忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａ Ｗｉｌｌｄ． ｅｘ Ｒｏｅｍ． ｅｔ Ｓｃｈｕｌｔ）、唐古特忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｔａｎｇｕｔｉｃａ Ｍａｘｉｍ）。2010年５月中旬于西寧市植物園采集９種忍冬屬植物的嫩葉，采集的植物材料經(jīng)清洗消毒后立即裝入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于超低溫冰箱保存。

１．２試驗(yàn)方法

１．２．１酶液的提取?。?ｇ嫩葉用液氮研磨至細(xì)粉后，加入２ ｍＬ 預(yù)冷的０．１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．８的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ于冰浴中提?。?ｈ，４ ℃ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，上清液即為酶的粗提液，－２０ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２電泳及染色

１）加樣和電泳。采用６％分離膠、３％濃縮膠和不連續(xù)垂直板進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳進(jìn)樣量２０ μＬ，初始電壓７０ Ｖ，待指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后，穩(wěn)壓２００ Ｖ電泳。

２）染色。ＰＯＤ同工酶顯色采用醋酸聯(lián)苯胺法［７］。酶帶的相對遷移率Ｒｆ計(jì)算公式為：

Ｒｆ＝酶帶遷移的距離／溴酚藍(lán)指示劑遷移的距離。

２結(jié)果與分析

２．１同工酶電泳結(jié)果

忍冬屬９種植物的ＰＯＤ同工酶電泳結(jié)果模式圖見圖１。由圖１可見，９種植物ＰＯＤ同工酶電泳共出現(xiàn)８條酶帶，酶帶條數(shù)最多的是紅脈忍冬，有５條；酶帶數(shù)量最少的是盤葉忍冬，僅有２條。其中ＰＯＤ－１是忍冬屬植物共有的特征酶帶，另外蘭果忍冬和紅脈忍冬各有一條特征酶帶，分別為ＰＯＤ－２和ＰＯＤ－３。

２．２同工酶聚類分析

根據(jù)ＰＯＤ同工酶電泳后的酶帶分布結(jié)果，以０和１統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移率位置上有酶帶的記為１，無酶帶的記為０，得出酶譜的二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣，根據(jù)酶譜的二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣，采用Ｊａｃｃａｒｄ結(jié)合系數(shù)和類平均法（ＵＰＧＭＡ）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖２。由圖２可知，在Ｊａｃｃａｒｄ系數(shù)０．６０處可以將供試的９種植物分成３大類，即唐古特忍冬、紅脈忍冬、華西忍冬、蘭果忍冬、隴塞忍冬、小葉忍冬聚為第一大類，盤葉忍冬獨(dú)自為第二大類，金花忍冬和金銀木聚為第三大類。

２．３同工酶電泳聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果的比較

根據(jù)忍冬屬植物不同品種的形態(tài)學(xué)可將試驗(yàn)的9個(gè)忍冬屬品種分為輪花亞屬和忍冬亞屬，其中忍冬亞屬包括直管組、囊管組、空枝組和忍冬組。試驗(yàn)選取的９個(gè)植物品種在形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果見圖３。由圖３可見，同工酶聚類分析中唐古特忍冬、紅脈忍冬、華西忍冬、蘭果忍冬、隴塞忍冬、小葉忍冬聚為第一大類，盤葉忍冬獨(dú)自為第二類，金花忍冬和金銀木聚為第三大類的聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類中的唐古特忍冬、隴塞忍冬、小葉忍冬、紅脈忍冬、華西忍冬、蘭果忍冬歸為囊管組，金花忍冬和金銀木歸為空枝組和盤葉忍冬歸為彎花亞組的分類結(jié)果是一致的，但是在囊管組中唐古特忍冬與紅脈忍冬的聚類結(jié)果與同工酶聚類分析的分類結(jié)果存在差異。

３小結(jié)與討論

同工酶是由結(jié)構(gòu)基因編碼的，是基因的直接產(chǎn)物，且能反映在同工酶酶譜上，具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段特異性，另外，由于所處生長環(huán)境的不同也會引起同工酶酶譜差異（包括酶帶數(shù)目、帶型、遷移率等）。酶譜分析時(shí)，酶帶數(shù)目的多少或某位置有無是分類的主要依據(jù)；酶帶深淺表示酶活性的強(qiáng)弱和酶量的多少，為量的差別。當(dāng)酶帶數(shù)目相同但相對遷移率或酶活性不同時(shí)，仍然可作為種（尤其是品種）鑒定的依據(jù)［８］。

試驗(yàn)結(jié)果表明，ＰＯＤ同工酶電泳顯示ＰＯＤ－１為９種植物共有的酶帶，因而可作為忍冬屬植物的鑒定依據(jù)；ＰＯＤ－２為蘭果忍冬特有的酶帶，ＰＯＤ－３為紅脈忍冬特有的酶帶，因而這兩條酶帶可分別作為這兩種植物的分類鑒定依據(jù)。另外，同工酶電泳結(jié)果表明金花忍冬和金銀木的ＰＯＤ同工酶酶譜完全一致，表明金花忍冬和金銀木具有很近的親緣關(guān)系。

上述研究結(jié)果表明ＰＯＤ同工酶酶譜在忍冬屬植物不同種之間表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，利用ＰＯＤ同工酶酶譜建立的忍冬屬植物鑒定體系對于忍冬屬植物分類鑒定有著十分重要的意義，可為忍冬屬植物的鑒定提供有力的依據(jù)。雖然ＰＯＤ同工酶酶帶在試驗(yàn)的9種植物中表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性，但同工酶分類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果也不完全吻合，這可能是因?yàn)槊缸V型只是一種表型，盡管它含有重要的生物學(xué)信息，但會受環(huán)境和人為因素的影響，在試驗(yàn)過程中會由于各種原因?qū)е虏糠謹(jǐn)?shù)據(jù)丟失，不能直接反映分子水平上的差異。因此，在今后的研究中應(yīng)該開展多酶研究，結(jié)合多酶系統(tǒng)和形態(tài)特性以及生態(tài)、地理分布的研究，提高取材的代表性，使忍冬屬植物的親緣關(guān)系和分類更趨合理和真實(shí)，以便為忍冬屬植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 朱穎，董玉芝，昝少平，等． １５種忍冬屬植物的數(shù)量分類研究［Ｊ］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００９，４６（４）：６９１－６９５．

［２］ 洪浩．青海忍冬屬植物的引種栽培［Ｊ］．青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），２００５（２）：７１－７３，３１．

［３］ 樊守金，趙遵田．中國莧屬植物酯酶同工酶研究［Ｊ］．植物研究，１９９９，１９（２）：１４８－１５２．

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［６］ 趙永亮，張長付，覃曉娟．金銀花的過氧化物酶和淀粉酶同工酶遺傳多樣性研究［Ｊ］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，２００８，３６（１５）：６２２５－６２２７．

［７］ 張龍翔，張庭芳，李令媛．生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［Ｍ］．北京：高等教育出版社，１９８１．

［８］ ＲＯＯＳＥ Ｍ Ｌ． Ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｐｌｏｉｄ ｐｌａｎｔ Ｓｔｅｐｈａｎｏｍｅｒｉａ ｅｘｉｇｕａ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９８４，２２（７－８）：６３１－６４３．