謝佳琦 李賀
摘要:以3個沙棘品種(亞歷山大12號、實優(yōu)1號和丘伊斯克×中國無刺雄)的果實為材料,通過氣-質(zhì)聯(lián)用法建立了沙棘種子油中脂肪酸組成的微量分析技術(shù)。脂肪酸用標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行定性確證分析,脂肪酸組成用峰面積歸一法計算。結(jié)果表明,沙棘種子油中富含不飽和脂肪酸(71.2%~76.0%),其中亞油酸(C18∶2n-6)含量最高(35.6%~39.0%),α-亞麻酸(C18∶3n-3)含量次之(27.8%~33.4%)。
關(guān)鍵詞:沙棘(Hippophae L.);種子油;脂肪酸; 微量分析
中圖分類號:Q946.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:0439-8114(2012)15-3319-04
Microanalysis of Fatty Acids in Seed Oil in Sea Buckthorn (Hippophae L.)
XIE Jia-qi,LI He
(College of Environment and Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, Niaoning, China)
Abstract: A microanalysis method which was based on gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) was established to identify compositions of fatty acids in 3 kinds of seed oil of sea buckthorn, including Yalishanda-12, Shiyou-1 and Qiuyisike×Chinese-Wucixiong. Fatty acids were qualitatively determined according to the standards of fatty oil by MS. The compositions of fatty acids in seed oil were calculated by peak area normalization. The results indicated that unsaturated acids(71.2%~76.0%) were rich in seed oil. The content of linoleic acid was highest with the range between 35.6% and 39.0%, α-linolenic acid was second with the range between 27.8% and 33.4%.
Key words: sea buckthorn (Hippophae L.); seed oil; fatty acids; microanalysis
沙棘(Hippophae L.)又名醋柳,胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或小喬木,廣泛分布于歐亞兩洲的溫帶地區(qū),有6個種,12個亞種。中國是沙棘資源大國,種植面積已達(dá)200萬hm2,約占世界總面積的90%以上,其中西北、華北、西藏、四川等林區(qū)都有豐富的沙棘天然資源[1,2]。沙棘具有極強的生態(tài)適應(yīng)性,耐寒、耐旱、耐鹽堿,固氮和繁殖能力強,廣泛應(yīng)用于土壤改良和水土保持。另外,沙棘的經(jīng)濟(jì)價值較高,其果實富含維生素C、D、E,類胡蘿卜素、黃酮、不飽和脂肪酸等大量生物活性物質(zhì),可作為飲料、食品、化妝品和醫(yī)藥的原料[3-7]。
近幾十年,國際上開發(fā)利用沙棘的研究工作由食品逐漸轉(zhuǎn)入藥品領(lǐng)域,如用于生產(chǎn)藥用沙棘油等。沙棘油中富含不飽和脂肪酸,其中果油中的油酸含量最高,其次是棕櫚油酸,而種子油中含有豐富的亞油酸和亞麻酸[8-10]。沙棘種子油作為藥用原料,廣泛用于治療燒傷、燙傷和凍傷等,對扁桃體炎、口腔炎和結(jié)膜炎等都有顯著療效,另外它還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),對于心、腦血管系統(tǒng)疾病以及腫瘤、癌癥等有預(yù)防作用[11]。
我國從20世紀(jì)80年代中期開始,從俄羅斯、芬蘭等地引入多個沙棘優(yōu)良品種,結(jié)合國內(nèi)的種質(zhì)資源進(jìn)行良種選育,目前已選育出沙棘的新品種[12-14]。在沙棘種質(zhì)資源評價的過程中,沙棘油成分是品質(zhì)評價的重要指標(biāo),采用傳統(tǒng)的方法,如索氏提取[15]、超臨界CO2萃取[16,17]等,需要采集大量樣品,耗時費力,分析成本高。本試驗建立了一種微量提取沙棘種子油并分析其脂肪酸組成的方法,該方法不僅可準(zhǔn)確分析毫克級材料的脂肪酸組成,而且節(jié)省了分析成本,具有較好的應(yīng)用價值。
1材料與方法
1.1材料與試劑
沙棘材料:亞歷山大12號(ssp. mongolica)、實優(yōu)1號(ssp. mongolica)和丘伊斯克×中國無刺雄的果實均采自大連民族學(xué)院試驗地,-50 ℃保存。
37種脂肪酸甲酯混合物標(biāo)準(zhǔn)品(47885-U)和1.25 mol/L鹽酸-甲醇溶液購于Sigma公司。
正己烷、氯仿和甲醇均為色譜純試劑,購于Honeywell B&J公司;氯化鉀為國產(chǎn)分析純試劑。
1.2儀器
GCMS-QP2010 Plus氣質(zhì)聯(lián)用儀(島津,日本),真空冷凍干燥機(Labconco,美國)。
1.3方法
1.3.1沙棘種子油的微量提取?。盗@鋬霰4娴墓麑崳ǎ担?℃)于10 mL離心管,管口貼上封口膜(封口膜上用針扎適量小孔),打開Labconco真空冷凍干燥機,降溫至-50 ℃,放入該離心管,真空凍干4 d(0.11 mBar,-53 ℃)。凍干后,剝離果肉,取出種子(約0.3~0.5 g),于研缽中輕搗,倒入液氮快速研磨至粉末狀。稱取約100 mg左右樣品粉末于2 mL離心管中,分別加入1 mL氯仿-甲醇溶液(體積比為2∶1)和250 μL酸洗玻璃珠(0.5 mm),高速振蕩5 min,然后放入液氮速凍5 min,再于4℃下放置2 h,裂解細(xì)胞,將細(xì)胞裂解液于4℃以10 000 r/min離心10 min,收集上清,加入300 μL 1% KCl,混勻,瞬時離心1 min,收集氯仿層于另一離心管中,并用500 μL氯仿重新提取原來的離心管,合并氯仿層,在快速真空器中揮發(fā)至干。
1.3.2樣品甲酯化在上述的樣品中加200 μL正己烷和500 μL鹽酸-甲醇(1.25 mol/L)溶液,混勻,依次在60℃溫?。?h,-20℃中冷凍20 min后,加入250 μL 1% KCl溶液(m/V),混勻,分層后,收集正己烷層,揮發(fā)溶劑,于-20℃保存。分析前向樣品中加入500 μL正己烷,0.45 μm濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析。
1.3.3氣相色譜條件Rtx-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),柱溫120 ℃,氣化室溫度230 ℃,載氣(He)壓力98.1 kpa,氣流速度1.20 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流比20∶1。柱箱升溫程序:升溫至120 ℃,保持2 min,再以3 ℃/ min升溫至230 ℃,保持20 min。
1.3.4質(zhì)譜條件離子源(EI)溫度200 ℃,接口溫度230 ℃,檢測器電壓0.74 kV,溶劑切除時間1.8 min,質(zhì)量掃描范圍40~600 amu。
2結(jié)果與分析
2.1微量提取的出油率
如表1所示,采用微量提取法獲得的5粒沙棘果實的出油率均在20%以上,其中實優(yōu)1號的種子出油率達(dá)到37.8%,與索氏提取法、超臨界CO2萃取等方法相比,該法大大提高了種子的出油率。在凍干的果實中,丘伊斯克×中國無刺雄種子含量最高,但種子含油量相對較低;亞歷山大12號和實優(yōu)1號種子含量相對較低,但種子出油率較高,說明這2個沙棘品種的種子含油量較高,是提取沙棘油的理想原料。從果實總體干重來看,種子油含量差距不大,約在5.0%左右。
2.2種子油脂肪酸組成分析
經(jīng)優(yōu)化的37種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯總離子流圖見圖1。由圖1可知,該色譜條件可分離標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯。由圖2可知,樣本種子油中主要含有12種脂肪酸,分別是十四烷酸(C14∶0)、十五烷酸(C15∶0)、棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16:1)、十七烷酸(C17∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1n-9)、亞油酸(C18∶2n-6)、α-亞麻酸(C18∶3n-3)、花生酸(C20∶0)、反-11-二十烯酸(C20∶1)和二十二烷酸(C22∶0)。圖3-圖5是3個品種沙棘種子油的脂肪酸總離子流色譜圖,從樣品色譜圖看,該方法的甲酯化效果較好,樣品中的脂肪酸均得到了較好的分離。
通過峰面積歸一法計算并分析沙棘種子油中的主要脂肪酸相對含量(表2)。由表2可知,3個沙棘品種種子油的不飽和脂肪酸含量均高于70%,其中以亞油酸(C18:2n-6)和α-亞麻酸(C18:3n-3)為主,其次是油酸(C18:1n-9)。亞歷山大12號、實優(yōu)1號和丘依克斯×中國無刺雄的種子油中,亞油酸相對含量在35.6%~39.0%之間,平均為37.1%,其中亞歷山大12號最高;α-亞麻酸的相對含量在27.8%~33.4%之間,平均為30.3%,其中實優(yōu)1號最高。由此可見,亞油酸和α-亞麻酸是沙棘種子油中最主要的不飽和脂肪酸,這也是開發(fā)利用沙棘種子油的重要依據(jù)。
3討論
沙棘果肉和種子中的油脂含量很高,油脂含量是其主要的品質(zhì)指標(biāo)。由于基因型、海拔、氣候和成熟期等因素的影響,不同品種沙棘果實和種子的含油量有很大差異。一般來說,沙棘種子油含量變化在6%~20%(m/m)之間[18-20],種子油中占優(yōu)勢的是C18不飽和脂肪酸,包括油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)和亞麻酸(C18∶3),其中亞油酸(C18∶2n-6)和α-亞麻酸(C18∶3n-3)特別豐富[21,22]。
對于沙棘種子油的提取方法而言,目前主要包括索氏提取法、超臨界CO2萃取、氯仿-甲醇提取法等,這些方法常用于克級以上的油脂樣品分析,樣品量大。本試驗成功運用微量提取技術(shù)分析了沙棘種子中總脂肪酸的含量及組成,該方法不需要大量樣品,還可避免提取過程中的脂肪酸(尤其是不飽和脂肪酸)氧化分解產(chǎn)生的誤差,另外,甲酯化方法具有操作簡單、效率高、準(zhǔn)確以及重現(xiàn)性好的優(yōu)點,非常適合毫克級樣品的油脂分析。該方法對于指導(dǎo)種子的資源考察、品種評價等具有一定的應(yīng)用價值。
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