侯曉暉 陳祥盛

摘要：通過ＰＣＲ擴(kuò)增獲得了飛虱科３屬５種昆蟲的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列，對(duì)ＤＮＡ序列進(jìn)行測(cè)定，分析了其序列組成及變異。采用Ｍｅｇａ ４．０軟件，利用鄰接法（ＮＪ）和最大簡(jiǎn)約法（ＭＰ）進(jìn)行５種飛虱的系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示構(gòu)建的ＭＰ和ＮＪ分子系統(tǒng)樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，３個(gè)簇角飛虱屬物種中華簇角飛虱（Ｂｅｌｏｃｅｒａ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐額簇角飛虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飛虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ）單獨(dú)聚為一支，與偏角飛虱屬海南偏角飛虱（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）的親緣關(guān)系較近，與短頭飛虱屬顯脊短頭飛虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ）的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，分子生物學(xué)分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：飛虱科；簇角飛虱屬（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）；１６ Ｓ ｒＤＮＡ；系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)：Ｑ９６９．３５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）15－3355-03

Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｔｈｒｅｅ Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ １６ Ｓ ｒＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

ＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｈｕｉ１，２，ＣＨＥＮ Ｘｉａｎｇ－ｓｈｅｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｐｅｓｔ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｕｎｔａｉｎｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ５ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒｓ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ３ ｇｅｎｕｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ ｍｅｔｈｏｄ（ＭＰ） ａｎｄ ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ（ＮＪ） ｕｓｉｎｇ Ｍｅｇａ ４．０ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｏｐｏｌｏｇies ｏｆ ＭＰ ｔｒｅｅ ａｎｄ ＮＪ ｔｒｅｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｗere ｔｈｅ ｓａｍｅ． Ｂｅｌｏｃｅｒａ Ｓｉｎｅｎｓｉｓ， Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ ａｎｄ Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｏｎｅ ｇｒｏｕｐ， ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｃｌｏｓｅｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ ｗｈｉｌｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔa． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｗｉｔｈ ｔｈose ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ； Ｂｅｌｏｃｅｒａ； １６ Ｓ ｒＤＮＡ； ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ

飛虱科（Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ）隸屬于半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）蠟蟬總科（Ｆｕｌｇｏｒｏｉｄｅａ）［１］。該科昆蟲許多種類是重要的農(nóng)林害蟲，它們通過刺吸汁液、產(chǎn)卵或傳播植物病毒病等方式為害水稻、玉米、蘆葦、甘蔗、竹子等，給農(nóng)林生產(chǎn)造成巨大損失［２］。其中簇角飛虱屬（Ｂｅｌｏｃｅｒａ）為外形比較獨(dú)特的一個(gè)屬，其觸角矢狀，嚴(yán)重危害竹類植物［２，３］。該屬目前記錄５種，均為東洋種，僅中國云南、貴州、海南、廣東、臺(tái)灣等地有分布記載［２，４，５］。與簇角飛虱屬外形相似，同樣具備矢狀觸角的偏角飛虱屬（Ｎｅｏｂｅｌｏｃｅｒａ）也為害竹類植物，且與簇角飛虱屬的分布極其相似［１，２，５］。為了更好地進(jìn)行兩近緣屬的分類研究，選取飛虱科簇角飛虱屬、偏角飛虱屬及外類群短頭飛虱屬的５個(gè)物種，利用其１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，探討兩屬間及種間的分子進(jìn)化關(guān)系，以期為實(shí)際生產(chǎn)中害蟲的鑒定提供一定的科學(xué)依據(jù)。

１材料與方法

１．１實(shí)驗(yàn)材料

簇角飛虱屬中華簇角飛虱（Ｂ． ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、褐額簇角飛虱（Ｂ． ｆｕｓｃｉｆｒｏｎｓ）和爬竹簇角飛虱（Ｂ． ａｍｐｅｌｏｃａｌａｍｕｓ），偏角飛虱屬海南偏角飛虱（Ｎ． ｈａｉｎａｎｅｎｓｉｓ）及短頭飛虱屬顯脊短頭飛虱（Ｅｐｅｕｒｙｓａ ｄｉｓｔｉｎｃｔａ），采集地信息見表１，采樣后保存于無水乙醇中備用［６］。

１．２基因組ＤＮＡ的提取

將保存于無水乙醇中的供試蟲體研磨碎，采用柱式動(dòng)物基因組ＤＮＡ抽提試劑盒提取總ＤＮＡ，測(cè)定濃度后調(diào)整為１～２ ｎｇ／μＬ，保存于－２０ ℃冰箱備用。

１．３ＰＣＲ 擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［６］的方法，引物序列為１６Ｓ－ＰＦ ５′－ＧＣＣＴＧＴＴＴＡＴ ＣＡＡＡＡＡ

ＣＡＴ－３′；１６Ｓ－ＰＲ ５′－ＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＴＣＡ－３′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反應(yīng)體系為２５ μＬ，內(nèi)含１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．３），５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２，

０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ，０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ引物，１．０ Ｕ Ｔａｑ酶以及１ μＬ ＤＮＡ模板。ＰＣＲ反應(yīng)程序?yàn)椋海梗?℃預(yù)變性７ ｍｉｎ；９５ ℃變性５０ ｓ，５０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物用１．０％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段大小、純度及含量。

１．４ＰＣＲ產(chǎn)物回收與測(cè)序

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)于擴(kuò)增效果良好且足量的ＰＣＲ產(chǎn)物采用柱式膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，樣品濃度達(dá)１００ ｎｇ／μＬ以上時(shí)，送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

１．５序列分析及分子系統(tǒng)樹的重建

利用Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ ２．０對(duì)獲得的序列進(jìn)行比對(duì)，其參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)［７］，使用ＭＥＧＡ ４．０軟件分析各物種間１６ Ｓ ｒＤＮＡ的堿基組成、遺傳距離和轉(zhuǎn)換／顛換值等［８］，在Ｋｉｍｕｒａ－２－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型的基礎(chǔ)上，用鄰接法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ，ＮＪ）和最大簡(jiǎn)約法（Ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ，ＭＰ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在重建系統(tǒng)樹時(shí)，以顯脊短頭飛虱的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列作為外類群，同時(shí)應(yīng)用Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ［９］自舉檢驗(yàn)１ ０００次檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信值。

２結(jié)果與分析

２．１５種飛虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列堿基組成及序列變異

研究中獲得的5種飛虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列已登錄ＧｅｎＢａｎｋ，登錄號(hào)見表２。利用Ｍｅｇａ ４．０軟件對(duì)所測(cè)１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，這５種飛虱的１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列平均長度為４７７ ｂｐ（包括Ｇａｐ），其中Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分別為３７．３％、４０．８％、１４．１％、７．８％，Ａ＋Ｔ的平均含量為７８．１％，Ｇ＋Ｃ的平均含量為２１．９％；共檢測(cè)到變異位點(diǎn)１２３個(gè)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)５９個(gè)，自裔位點(diǎn)６４個(gè)，約占總序列的２５．８％。供試５種飛虱１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列間顛換高于轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換數(shù)／顛換數(shù)平均值為０．４８。

２．２系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

從各物種１６ Ｓ ｒＤＮＡ序列的遺傳距離（表２）來看，同屬物種間的遺傳距離較小，３種簇角飛虱間的遺傳距離為０．１５３～０．２９１；屬間遺傳距離較大，為０．４０１～０．９６４，其中３個(gè)簇角飛虱屬物種與海南偏角飛虱的遺傳距離為０．４０１～０．５２６，與顯脊短頭飛虱的遺傳距離均較遠(yuǎn)，為０．７５９～０．９６４。

根據(jù)序列分析結(jié)果，分別采用最大簡(jiǎn)約法（ＭＰ）和鄰接法（ＮＪ）構(gòu)建５種飛虱的分子系統(tǒng)樹，得到一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖１、圖２），Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ １ ０００次檢驗(yàn)系統(tǒng)樹各支均得到較高的支持率。從圖１和圖２中可以看出，簇角飛虱屬３個(gè)種聚為一支，與海南偏角飛虱有較近的親緣關(guān)系，短頭飛虱屬的顯脊短頭飛虱與其他４種飛虱的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

３討論

３．１屬間親緣關(guān)系

如前所述，偏角飛虱屬與簇角飛虱屬形態(tài)較為相似，關(guān)系密切。由遺傳距離分析結(jié)果來看，簇角飛虱屬物種與偏角飛虱屬間的遺傳距離為０．４０１～０．５２６，遠(yuǎn)高于屬內(nèi)物種之間的遺傳距離。另外，簇角飛虱屬與偏角飛虱屬雖親緣關(guān)系較近且互為姐妹群，但仍各自構(gòu)成一單系群，故兩者作為獨(dú)立的屬級(jí)階元是成立的；而簇角飛虱屬與短頭飛虱屬親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果非常吻合［２，５，９，１０］。

３．２屬內(nèi)親緣關(guān)系

目前，中國已報(bào)道５種簇角飛虱［１０］，其形態(tài)特征較相似，本研究涉及了其中３種，其中爬竹簇角飛虱與褐額簇角飛虱間的遺傳距離為０．１５３，而中華簇角飛虱與兩者的遺傳距離分別為０．２９１和０．２８３，表明其與這兩個(gè)物種的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這一結(jié)果與形態(tài)分類的結(jié)果相吻合［１０］。

綜上所述，本研究分析結(jié)果與丁錦華等［２］、Ｈｏｕ［１1］形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果一致，這為用分子手段與形態(tài)學(xué)分類方法相結(jié)合，進(jìn)行飛虱科昆蟲種屬的鑒定奠定了一定的基礎(chǔ)。

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