王紅英 錢春桃 張永兵 伊鴻平 郭勤衛(wèi) 劉佳 吳明珠 陳勁楓

摘要：對不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后測定葉片中葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和3種防御酶(PPO、PO、PAL)的活性。結果表明：葉綠素含量在接種后呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，抗病甜瓜增幅大。葉綠素含量高于感病甜瓜；可溶性糖含量在接種后先降低后升高、再降低再升高，抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜：可溶性蛋白含量在接種后逐漸升高，感病甜瓜峰值出現(xiàn)早于抗病甜瓜；3種酶活性在接種后都有不同程度提高。其中抗病甜瓜酶活性增幅高于感病甜瓜。幾種酶活性變化可以用于甜瓜蔓枯病抗性鑒定。

關鍵詞：甜瓜；蔓枯病菌；葉綠素；可溶性糖；可溶性蛋白；PPO；PO；PAL

甜瓜(Cucumis melo L.)蔓枯病是由Didymellabroniae(Auersw.)Rehm引起的一種真菌性病害，其發(fā)生常會導致毀滅性的后果。植物在受到病原菌侵入后，葉片組織會因病原菌侵入發(fā)生一系列變化。據報道。葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量和防御酶多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(PO)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)與黃瓜霜霉病、黃瓜白粉病、西瓜枯萎病等多種病害的抗性有關。然而在不同抗病體系中，植物的抗病機制表現(xiàn)不盡相同，有關不同抗性甜瓜接種蔓枯病菌后的影響還未見報道。因此，筆者選取抗病和感病甜瓜材料。對其接種蔓枯病菌后測定分析葉片中一些生理指標和幾種保護酶活性的變化，以進一步探討這些指標與甜瓜蔓枯病抗性之間的關系。

1材料與方法

1.1材料

供試材料伊麗莎白為感病甜瓜(S)，由新疆農業(yè)科學院哈密瓜研究中心提供；PI 420145為抗病甜瓜(R)，由美國康乃爾大學Molly John教授提供。抗、感病材料均經過課題組多代自交和蔓枯病抗性鑒定。供試蔓枯病菌為本實驗室分離純化并保存的A型菌株，該菌株的分生孢子在僅含磷酸二氫氨的馬鈴薯平板培養(yǎng)基上，經7 d暗培養(yǎng)和4 d間歇紫外燈(12 h紫外燈/12 h黑暗)處理的光照條件下產生。

1.2抗性鑒定

抗性鑒定試驗于2010年秋季在南京農業(yè)大學園藝站塑料大棚內進行，抗、感材料各60株，30株接種鑒定，30株用清水噴施作為對照，3次重復。接種鑒定參照Zhang等的方法進行，在甜瓜植株長到3-4片真葉時，選取長勢一致的植株對葉部和莖部同時噴施接種，蔓枯病菌孢子懸浮液體積濃度為1×10⁵個·mL^-1。接種后覆蓋棚膜保濕3 d，溫度控制在25℃左右，于接種后第7天統(tǒng)計發(fā)病情況，病情嚴重程度分級標準為：

莖部：1級，無傷害；2級，單個病斑長1-10mm，或者多個病斑總長1-20 mm但未環(huán)莖1周；3級，病斑21-80mm，或是環(huán)莖1周；4級，莖蔓萎蔫；5級，植株死亡。1-2級為抗病，3-5級為感病。

葉部：1級，侵染面積為0；2級，侵染面積≤25％；3級，25％<侵染面積≤50％；4級，50％<侵染面積≤75％；5級，侵染面積>75％。1-2級為抗病，3-5級為感病。

1.3取樣方法

接種處理前取樣1次，接種后每天取樣1次，取8 d，共取9次(每次均取相同部位功能葉)，用于各生理指標測定，測定結果取3次重復平均值。

1.4生理指標測定

參照沈偉其的方法測定葉綠素含量(略有改動)：植物葉片約4g，于液氮中研磨，然后加入在65℃水浴中預熱提取緩沖液約900μL，并振蕩搖勻，再加入巰基乙醇約20μL，65℃水浴30min；加入5mol·L^-1KAC 300μL，冰浴30-60 min，12000轉·min^-1，離心10min：清液加入1/5體積的5％CTABBuffer上下顛倒充分搖勻，65℃水浴20min；待冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿/異戊醇(24：1)抽提2次，室溫11000轉·min^-1，離心5min；如界面渾濁，再抽提1-2次；取上清液，加入2/3體積的異丙醇，上下顛倒充分搖勻，室溫放置10min，12000轉，min^-1，離心10min；棄上清液，用70％乙醇洗滌沉淀2次，抽干沉淀，加TE溶解。加1/10體積的Rnase(約40μL，10mg·mL^-1)處理DNA樣品，37℃，30min；加入等體積的氯仿，異戊醇(24：1)抽提2次，吸上清液加110體積的3mol·L^-1NaAc(pH值5.2)，2倍體積的無水乙醇搖勻，-20℃放置10 min；4℃，6000轉·min^-1離心5min，用70％乙醇洗滌沉淀2次，抽干沉淀，加適量TE Buffer溶解，取2μL與0.8％瓊脂糖凝膠中。100 V電泳30 min。其余-20℃保存。用蒽酮法測定可溶性糖含量。用考馬斯亮藍G-250法測定可溶性蛋白含量。PPO和PO液提取參照譚興杰等的方法。PAL液提取參照秦鑫等所采用的方法。

2結果與分析

2.1甜瓜接菌后葉綠素含量變化

圖1顯示，接種前抗病甜瓜葉綠素含量高于感病甜瓜。接種后抗、感病甜瓜葉綠素含量開始均呈增加趨勢，抗病甜瓜增幅大于感病甜瓜：抗病甜瓜和感病甜瓜第1個峰值均出現(xiàn)在接種后第2天，達到峰值后均呈現(xiàn)不同程度的下降，并分別在接種后第6天和第5天出現(xiàn)第2個峰值。之后抗病甜瓜和感病甜瓜葉綠素含量繼續(xù)下降，至第8天時葉綠素含量均低于對照，但抗病甜瓜葉綠素含量一直高于感病甜瓜。抗、感病甜瓜對照葉綠素含量均有小幅度下降。

2.2甜瓜接菌后可溶性糖含量變化

圖2顯示，接種前抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜可溶性糖含量變化趨于一致，即下降、升高、再下降、再升高，均在第8天升到最高點?？共√鸸辖臃N后可溶性糖含量出現(xiàn)大幅度下降，第3天降到最低點，接種后第5天開始再次出現(xiàn)大幅度下降：感病甜瓜接種后可溶性糖含量第1天下降，隨后上升，第3天開始出現(xiàn)較大幅度的下降，第5天降至最低點，隨后開始上升，第7天快速上升。不同抗性甜瓜在不同時期可溶性糖含量變化不同：接種初期，抗病甜瓜可溶性糖含量下降幅度較大，后期上升幅度也較大：感病甜瓜變化幅度不大，且可溶性糖含量均低于抗病甜瓜。抗、感病對照甜瓜可溶性糖含量基本處于穩(wěn)定不變的狀態(tài)。

2.3甜瓜接茵后可溶性蛋白含量變化

圖3顯示，接種前，抗病甜瓜可溶性蛋白含量高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜可溶性蛋白含量均增加，且變化趨勢大體相同，先緩慢升高、再快速升高、再下降。但不同抗性甜瓜可溶性蛋白含量具體變化又不同：抗病甜瓜可溶性蛋白含量緩慢上升，峰值出現(xiàn)在接種后第3天。而后降幅相對平緩，第6天降幅增大后再平緩；感病甜瓜上升很快，峰值出現(xiàn)在接種后第2天，而后快速下降至第4天趨于平緩，最后抗、感病甜瓜均逐漸降低至正常水平。除第2

天感病甜瓜可溶性蛋白含量略高于抗病甜瓜外，其余均明顯低于抗病甜瓜?？?、感病甜瓜接種后第8天可溶性蛋白含量接近對照?？?、感病對照可溶性蛋白含量基本沒有變化。

2.4甜瓜接菌后3種防御酶活性變化

2.4.1 PPO活性變化圖4顯示，接種前，抗病甜瓜PPO活性顯著高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜PPO活性都有不同程度提高。均在第6天達到峰值，抗病甜瓜的增幅及峰值顯著大于感病甜瓜，之后均有不同程度的下降，但都明顯高于對照?？共√鸸螾PO活性一直高于感病甜瓜?？?、感病對照甜瓜PPO活性基本沒有變化。

2.4.2 PO 活性變化 圖5顯示，接種前，抗、感病甜的PO活性略高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜第1、2天PO活性增幅不明顯，第3、4天出現(xiàn)大幅度的增加，隨后上升幅度基本趨于平穩(wěn)：感病甜瓜PO活性變化趨勢與抗病甜瓜基本相同，但上升幅度

略低于抗病甜瓜。接種前后抗病甜瓜PO活性均高于感病甜瓜。從接種后第4天開始，抗、感病甜瓜PO活性顯著高于對照，抗、感病對照的PO活性基本無變化。

2.4.3 PAL 活性變化 圖6顯示，接種前?？共√鸸螾AL活性高于感病甜瓜。接種后，抗、感病甜瓜PAL活性均呈上升趨勢，均在第4天達到峰值，隨后逐漸下降趨于正常：接種后第8天抗病甜瓜PAL活性略高于對照，感病甜瓜與對照趨于一致。感病甜瓜PAL活性相對穩(wěn)定，抗病甜瓜接種前后PAL活性均高于感病甜瓜。抗、感病對照PAL活性變化不大。

3討論

在本研究中抗病甜瓜葉綠素含量一直高于感病甜瓜，暗示葉綠素含量與蔓枯病抗性存在一定程度的正相關。接種后，抗病甜瓜可以進一步合成葉綠素促進光合作用和營養(yǎng)物質的合成，增強了植物的抗病性。接種前抗病甜瓜可溶性糖含量高于感病甜瓜。接種后抗、感病甜瓜可溶性糖含量變化基本一致，糖含量的變化與抗性沒有明顯的關系。然而劉慶元等對黃瓜霜霉病的研究認為黃瓜葉內可溶性糖含量越高，其抗病性越強，否則就越弱。劉素萍等認為糖是病原菌生長繁殖必須的營養(yǎng)物質，糖含量越高是促進植物感病的一個重要因素，本試驗結果與其報道不相符。糖含量的高低在不同品種間與抗性的關系是不完全相同的。接種前抗病甜瓜可溶性蛋白含量高于感病甜瓜，接種后感病甜瓜峰值出現(xiàn)早于抗病甜瓜，說明感病甜瓜比抗病甜瓜對病原菌的侵入更為敏感，抗病性與植物對病原菌侵染的反應呈負相關。

本研究結果表明。接種后甜瓜PPO、PO和PAL活性顯著提高，抗病品種酶活性升高的相對幅度大于感病品種，說明抗病品種的抗性與酚類代謝物質代謝活性相關，酚類物質的分泌能夠增加植物的抗性，次生代謝酶活性增強是甜瓜抗病性的重要生化機制。PPO、PO和PAL對蔓枯病病原菌的侵染具有積極作用，根據其是否接種蔓枯病菌的變化規(guī)律，可以為甜瓜蔓枯病的接種鑒定提供參考。

4結論

本研究結果表明，甜瓜植株在受蔓枯病菌侵染后，抗、感病材料葉片中的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量較對照均發(fā)生了明顯的變化，抗病材料的PPO、PO及PAL活性均高于感病材料。這些酶活性的變化與甜瓜蔓枯病抗性有密切關系。