張少斌，王 粲，劉 慧，劉 曦

(沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866)

肌動蛋白(Actin)是真核生物中普遍存在的一種古老的蛋白質(zhì)，是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，也是維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及生長發(fā)育的基礎。Actin最早在動物骨骼肌細胞中被發(fā)現(xiàn)，我國科學家閻隆飛等[1]首次證明了植物Actin的存在。在細胞中肌動蛋白結(jié)合蛋白(Actin binding proteins，ABPs)調(diào)控下，Actin微絲的長度、極性、穩(wěn)定性和三維結(jié)構(gòu)處于動態(tài)變化之中，并將Actin纖維與細胞漿和細胞膜的其它成分相連接，從而調(diào)節(jié)Actin的理化狀態(tài)，藉以完成多種細胞功能，包括細胞分裂[2]、內(nèi)吞作用[3]、細胞信號傳導[4,5]、重力感應[6,7]、細胞頂端生長[8,9]、細胞器運動[10～12]等。

近年來，人們陸續(xù)從高等動植物體中克隆了Actin基因，并分離純化出許多肌動蛋白異型體。通過對擬南芥Actin基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析，將它們分成營養(yǎng)型肌動蛋白(Vegetative actin)和生殖型肌動蛋白(Reproductive actin)，其表達具有明顯的組織特異性，并且在大多數(shù)組織和器官中往往同時大量表達著兩種以上的肌動蛋白異型體[13]，且不同肌動蛋白異型體的表達具有時空的特異性，發(fā)揮作用也不盡相同。

作者在此采用RT-PCR技術克隆了豌豆肌動蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，并作了生物信息學分析，推斷了編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，擬為進一步研究其結(jié)構(gòu)與其生物學作用之間的聯(lián)系奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料及主要試劑

豌豆(Pisumsativum.)卷須采自溫室培養(yǎng)的豌豆植株；大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pET-30，實驗室保存；克隆載體pGEM-T easy，Promega公司；dNTP、Taq聚合酶、膠回收試劑盒、TRizol，Takara公司；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

引物合成及測序由上海生工生物技術有限公司完成。

1.2 肌動蛋白基因克隆與測序

總RNA提取采用TRizol法，0.1 g卷須加入1 mL TRizol。參照張少斌等[14]的RT-PCR方法，首先將mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI檢索到的PEAc3序列，設計引物如下：

上游：GC GAATTC ATGGCAGAATCCGA-AGATAT(EcoRI)；下游：GC GGTACC GAAGCATTTCCTGTGTAC(KpnI)。

反應條件為：95 ℃熱變性5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環(huán)，72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反應結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。參照DNA膠回收純化試劑盒說明，將PCR擴增產(chǎn)物的特異性片段進行膠回收，與pGEM-T easy載體連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍白斑篩選，隨機挑取白斑進行PCR和酶切鑒定，鑒定正確的菌株送上海生工生物技術有限公司測序。

1.3 肌動蛋白生物信息學分析

應用DNAMAN 6.0生物學軟件查找測序得到的核苷酸序列的開放讀碼框，將PEAc3基因的核酸序列翻譯成氨基酸序列，并進行多序列比對，應用生物信息學軟件對氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)與功能分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEAc3的克隆與鑒定

RT-PCR產(chǎn)物的質(zhì)量是關系到最后能否得到正確序列的關鍵因素，從豌豆總RNA中通過RT-PCR擴增PEAc3的序列結(jié)果見圖1A。

A.RT-PCR擴增PEAc3 B.重組載體的PCR鑒定 C.重組載體的雙酶切鑒定

由圖1A可知，條帶清晰，大小在1000 bp左右，與核酸序列數(shù)據(jù)庫登記的大小一致。將擴增產(chǎn)物膠回收后連接到pGEM-T easy克隆載體，構(gòu)建重組載體pGEM-T-PEAc3，經(jīng)PCR鑒定(圖1B)和酶切鑒定(圖1C)正確后，送到上海生工生物技術有限公司測序。

2.2 PEAc3序列同源性分析

經(jīng)序列測定，應用DNAMAN軟件分析核酸序列測序結(jié)果，證實為具備完整開放閱讀框的肌動蛋白基因，并推測了其氨基酸序列，與Genbank中注冊的PEAc3序列相比，只有2個氨基酸的差異，分別是328位的S變?yōu)镮、349位的A變?yōu)镾，具體序列如圖2所示。

圖2 克隆的PEAc3氨基酸序列

肌動蛋白基因家族是一個多基因家族，一般具有多個拷貝，碗豆肌動蛋白基因家族進化關系比較見圖3。

圖3 豌豆肌動蛋白基因家族進化關系比較

由圖3可知，通過RT-PCR克隆出的PEAc3基因(圖3中標注為PEAc3 RT-PCR)與Genbank中注冊豌豆肌動蛋白家族基因序列比對發(fā)現(xiàn)，與PEAc9、PEAc12及PEAc3基因注冊序列的親緣關系較近，這與它們同屬于同一類基因家族PEAcⅡ相一致，其中與注冊的PEAc3同源性最高，為99%。而因PEAc3基因與PEAc1、PEAc17、PEAc14屬于不同的豌豆肌動蛋白異型體類別，相應的進化關系較遠。

將PEAc3與在NCBI文庫中檢索到的100多種植物Actin基因進行序列比對，同源性高達89.07%，而且在位點339和350處都是高度保守的，僅同屬豌豆PEAcⅡ類肌動蛋白基因家族的6條注冊序列PEAc3(AAB18641和AAB38511)、PEAc9(AAB18642和AAB38512)和PEAc11(AAB18643和AAB38513)在該位點存在差異。

在檢索到的Actin氨基酸序列中隨機選擇8條(包括PEAc3在內(nèi)，還有綠豆、擬南芥、大麥、大豆、煙草、獼猴桃和三葉草)比較同源性，結(jié)果見表1。

表1 PEAc3與其它7種植物Actin基因的氨基酸序列同源性的比較/%

由表1可看出，PEAc3基因與綠豆的肌動蛋白基因親緣關系較近，這與系統(tǒng)分類學中豌豆與綠豆同屬于豆科相一致，但是與大豆親緣關系則相對較遠。其次是與禾本科的大麥親緣關系相對較近，肌動蛋白在真核生物種內(nèi)與種間基因存在著不同程度的變異，而且存在大量的肌動蛋白異型體，這使得在分子水平上研究植物界的肌動蛋白基因的進化規(guī)律較為困難。

2.3 PEAc3序列指紋圖譜分析(圖4)

圖4 PEAc3序列指紋圖譜分析

應用DNAMAN6.0推測長度為1134 bp的PEAc3核酸序列，得到了長度為377的氨基酸序列。經(jīng)疏水性、SignalP 3.0、ProtParam和ScanProfile程序分析推斷，PEAc3分子量為41 668.7 Da，理論等電點為5.31，帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為38個，帶負電的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為50個。PEAc3是由3組序列指紋圖譜(Signature)組成的一組序列模體，沒有信號肽部分，以成熟蛋白形式存在，經(jīng)SOSUI程序分析推測該肌動蛋白為可溶性蛋白。

2.4 PEAc3疏水性分析

疏水性分析結(jié)果顯示，疏水性最高比值為2.300，親水性最高比值為2.200(比值浮動范圍為4，數(shù)值越高表示該特性越強)，應用TMHMM 2.0程序?qū)Φ鞍變?nèi)部跨膜區(qū)的預測與疏水性結(jié)果基本相符。預測蛋白可能的跨膜區(qū)有3個或2個，位于氨基酸序列位點137～157、304～322和348～366(N端開始)，但是第二個區(qū)域304～322位點間的疏水性不是很強，程序預測也可能是2個跨膜區(qū)，位于氨基酸序列位點141～157和348～366。

2.5 討論

除了ACTINS_1上結(jié)合一些小分子，ACTINS_2高度保守的色氨酸也與N端谷氨酸共同作用結(jié)合Ca2+、天冬氨酸結(jié)合Sr2+，這些結(jié)合能力為PEAc3在體內(nèi)發(fā)揮細胞信號轉(zhuǎn)導功能奠定了決定性的基礎。同時色氨酸也是熒光素RHO通過范德華力結(jié)合的位點，所以推測這也可能是鬼筆環(huán)肽法活體標記微絲后不能解聚及無法標記單體肌動蛋白的原因。Ca2+存在下微絲解聚成單體肌動蛋白，熒光素與Ca2+共同競爭色氨酸位點，若熒光素競爭力強，則Ca2+無法再結(jié)合，微絲不能解聚；而當Ca2+存在下，ACTIN以單體形式存在，鬼筆環(huán)肽標記物也無法再結(jié)合。

ACTINS_ACT_LIKE序列中沒有發(fā)現(xiàn)任何配體的結(jié)合位點，它折疊纏繞在三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，作為保守的序列指紋圖譜很可能起到不可取代的結(jié)構(gòu)支撐作用。有趣的是這段序列是Actin和肌動蛋白結(jié)合蛋白共有的序列指紋圖譜，其意義目前還無法解釋清楚。

PEAc3屬于豌豆肌動蛋白家族的Ⅱ類異型體，主要在幼嫩組織中表達。以上只是在Actin結(jié)構(gòu)基礎上的功能預測，在具體的時空中如何表達，真正發(fā)揮哪些作用還需要對該蛋白及其結(jié)合蛋白進一步深入研究。

3 結(jié)論

根據(jù)NCBI文庫中檢索到的序列，采用RT-PCR技術克隆了豌豆肌動蛋白異型體PEAc3完整編碼區(qū)的cDNA序列，基因全長1134 bp，開放閱讀框編碼377個氨基酸。氨基酸序列分析表明，該基因的編碼蛋白PEAc3為可溶性蛋白，分子量41 668.7 Da，沒有信號肽部分，呈酸性，PEAc3包括ACTINS_1(編號：PS00406)、ACTINS_ACT_LIKE(編號：PS01132)以及ACTINS_2(編號：PS00432)3組肌動蛋白序列指紋圖譜(Signature)。序列同源性分析表明PEAc3與其它上百種植物肌動蛋白同源性高達89.07%。

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