引種互葉白千層茶樹油有效抑菌成分辨析*

鐘振聲,袁裕泉,樊麗妃

(華南理工大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，廣東 廣州 510640)

互葉白千層茶樹原生長于澳大利亞，從該種茶樹枝葉提取的茶樹油具有殺菌消炎[1-2]、修復(fù)皮膚輕微創(chuàng)傷的功效，是天然的護(hù)膚品。上世紀(jì)80年代后，植物源殺菌劑日益受到重視，茶樹油產(chǎn)業(yè)得以迅速發(fā)展，我國廣東、廣西、云南等地從1993年起先后成功引種互葉白千層茶樹[3]。

茶樹油的品種會因氣候、土壤條件等種植因素不同而發(fā)生變異，自然形成茶樹油成分含量不同的新品種[4]。前期研究曾對廣西玉林、廣東從化和江西吉安不同地方引種澳大利亞互葉白千層茶樹所產(chǎn)的茶樹油進(jìn)行化學(xué)成分分析，研究其化學(xué)差異性，并給出了抑菌效果試驗評價[5]。然而，由于茶樹油化學(xué)成分十分復(fù)雜，尚未能在茶樹油有效成分與抑菌活性之間建立起相應(yīng)關(guān)系。

本文采用分餾法將從不同種植地點采集的茶樹油進(jìn)行餾分分離，對各餾分的主要成分和抑菌活性作對比研究，試圖確定抑菌性能與某些化學(xué)成分之間存在的對應(yīng)關(guān)系，為茶樹品種的選育和茶樹油的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試驗用茶樹油分別來自廣西玉林、江西吉安和廣東從化茶樹種植基地，為水蒸氣蒸餾法得到的精油。丙酮、氯化鈉及氫氧化鈉均為分析純試劑；瓊脂、牛肉浸膏、蛋白胨均為生化試劑。供試菌種大腸桿菌Escherichiacoli、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus購于廣州工業(yè)微生物檢測中心菌種庫。

QP2010 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)，日本SHIMADZU公司； SPX-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械公司；XS-212型生物顯微鏡，南京江南永新光學(xué)公司；SW-CJ-1D型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備公司；YX-280D型壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備公司；10 mm×7.8 mm×(6±0.1)mm型牛津杯，浙江寧海健民醫(yī)療儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶樹油分餾 采用實驗室常規(guī)精密分餾裝置，理論塔板數(shù)約90，對茶樹油進(jìn)行緩慢加熱分餾。先用常壓蒸餾得到較低沸點的前餾分，然后在0.006 3 MPa減壓蒸餾，分別得到不同溫度段的餾分。

1.2.2 GC/MS分析 用電子天平精密稱取茶樹油，用丙酮配制成濃度約為5 mg/mL 的樣品溶液。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對茶樹油進(jìn)行定性定量分析[6]。

色譜條件：色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；樣口溫度260 ℃；載氣為高純氦；柱流量1.0 mL/min；分流比100∶1；進(jìn)樣量1 μL；程序升溫起始溫度70 ℃，速率10 ℃/min，終止溫度180 ℃。質(zhì)譜條件：電離方式EI；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；溶劑延遲2 min；加速電壓1.00 kV；掃描范圍45～500 amu。

1.2.3 抑菌活性測定 采用牛津杯法測不同濃度茶樹油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，以相同濃度的溶劑做對比實驗。

用液體稀釋法[7]測茶樹油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度。用無菌φ=5%吐溫-80配制一系列不同濃度的茶樹油。量取4.5 mL無菌培養(yǎng)液于試管中，加入0.5 mL不同濃度茶樹油，再加入104cfu/mL菌液50 μL，使得茶樹油最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為分別2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%，0.062 5%。細(xì)菌置37 ℃搖床24 h，真菌置27 ℃搖床24 h后，取20 μL涂板看菌生長情況。無菌生長即相應(yīng)濃度為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 廣西玉林茶樹油抑菌成分的辨識

對廣西玉林茶樹油進(jìn)行分餾操作，共得到5個餾分。分別作GC/MS檢測，結(jié)果匯集于表1。

由表1可知，廣西玉林茶樹油的主要成分是1,8-桉葉素(72.49%)、苧烯(8.57)、α-松油醇(8.27%)和α- 蒎烯(3.96%)，而常規(guī)的特征成分4-松油醇、α-松油烯、γ-松油烯和異松油烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別不足1%，屬于桉型茶樹油[8]。該成分構(gòu)成與國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730:2004各項指標(biāo)差距甚遠(yuǎn)[9]。

選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為供試菌，研究廣西玉林茶樹油5種不同餾分的抑菌性能。抑菌圈直徑和最小抑菌濃度試驗結(jié)果如表2所示。

綜合表1和表2試驗數(shù)據(jù)，廣西玉林茶樹油的主要抑菌成分集中在170～180 ℃的餾分，對兩種受試菌的最小抑菌濃度都只有w=0.125%，當(dāng)w低至10%就有顯著抑菌作用。該餾分當(dāng)中1,8-桉葉素的w達(dá)到93.35%。其他成分含量很低，對抑菌作用的影響很小。而>180 ℃餾分中盡管4-松油醇和α-松油醇含量很高，但是1,8-桉葉素的含量只有170～180 ℃餾分含量的1/9，該餾分無抑菌效果。因此可以確認(rèn)廣西玉林茶樹油的主要抑菌成分為1,8-桉葉素而不是4-松油醇和α-松油醇。而140～160 ℃餾分1,8-桉葉素的w為82.07%，但是并無抑菌效果。與同濃度未分離的廣西玉林茶樹油相比，分離之后抑菌效果比其稍差[10]，因此此茶樹油的抑菌效果應(yīng)該還有其他成分的協(xié)同作用。

表1 廣西玉林茶樹油各餾分化學(xué)成分分析結(jié)果

表2 廣西玉林茶樹油各餾分的抑菌圈直徑和最小抑菌濃度

2.2 江西吉安茶樹油抑菌成分的辨識

對江西吉安茶樹油先常壓分餾，然后在減壓分餾下分別得到5個餾分。分別作GC/MS檢測，結(jié)果匯集于表3。

表3 江西吉安茶樹油各餾分化學(xué)成分分析結(jié)果

由表3可知，江西吉安茶樹油的主要成分是1,8-桉葉素(20.17%)、α-松油醇(23.77%)、(+)-檸檬烯(16.22%)、1，4-桉葉素(10.50%)等。該成分構(gòu)成與國際標(biāo)準(zhǔn)ISO4730:2004各項指標(biāo)差距也比較大。

選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為供試菌，研究江西吉安茶樹油五種不同餾分的抑菌性能。抑菌圈直徑和最小抑菌濃度試驗結(jié)果如表4所示。

綜合表3和表4試驗數(shù)據(jù)，江西吉安茶樹油的主要抑菌成分集中在減壓分餾130 ℃以下的餾分。前餾分主要含有1,8-桉葉素(23.80%)、檸檬烯(17.61%)、對傘花烴(11.28%)等。<110 ℃的餾分主要含有1,8-桉葉素(23.51%)、檸烯(24.98%)、對傘花烴(13.26%)和α-松油醇(6.73%)等。100～130 ℃餾分主要含有α-松油醇(37.37%)、1,8-桉葉素(17.65%)、檸檬烯(9.39%)和對傘花烴(7.54%)。

據(jù)報道，原產(chǎn)于澳洲的茶樹油的主要成分是4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯和異松油烯等[11]，但在江西吉安茶樹油各具有抑菌作用的餾分中，很少出現(xiàn)以上成分。表3中數(shù)據(jù)顯示，從餾分(1)到餾分(5)，α-松油醇w依次是7.94%、6.73%、37.37%、59.97%、18.48%，前兩者α-松油醇含量低而抑菌活性高，后兩者α-松油醇含量高而抑菌活性低，不成比例。餾分(1)到餾分(3),4-松油醇的w依次是1.20%、1.10%、1.42%，4-松油醇含量很低而抑菌活性高；相反，餾分(4)4-松油醇的w為4.36%，比餾分(1)高3.6倍，可是卻沒有表現(xiàn)出多大抑菌活性。換句話說，江西吉安茶樹油的抑菌作用不是4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯和異松油烯等物質(zhì)引起的。

表4 江西吉安茶樹油各餾分的抑菌圈直徑(1)和最小抑菌濃度

值得留意的是1,8-桉葉素，在前三個餾分中w分別是23.80%、23.51%、17.65%，而正是這三個餾分表現(xiàn)出好的抑菌活性。后兩個餾分1,8-桉葉素w只有3.54%和0，對應(yīng)的抑菌活性非常低。1,8-桉葉素含量與抑菌活性之間表現(xiàn)出密切的關(guān)系。

2.3 廣東從化引種茶樹油抑菌成分的辨識

對廣東從化引種茶樹油進(jìn)行分餾操作，共得到5個餾分，分別作GC/MS檢測，結(jié)果匯集于表5。

選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為供試菌，研究廣東從化茶樹油5種不同餾分的抑菌性能。抑菌圈直徑和最小抑菌度試驗結(jié)果如表6所示。

表6的實驗數(shù)據(jù)表明，從化茶樹油分餾后所得的餾分(1)～(3)具有好的抑菌活性，其中活性最高的是低沸點的前餾分(1)。

表5數(shù)據(jù)顯示，從化茶樹油的前四大主要成分是α- 松油烯、對傘花烴、γ-松油烯和4-松油醇，合起來占總量的52.2%～76.87%，見表7。其中餾分(3)四種主要成分的w合計76.87%，餾分(4)四種主要成分的w合計70.61%，兩者差別很小，但是抑菌活性差別巨大。餾分(1)四種主要成分的w合計64.35%，比餾分(4)少，但抑菌活性卻大得多。所以，從四種主要成分的組合看不出與抑菌活性的關(guān)聯(lián)。

從單一成分看，抑菌活性與4-松油醇含量沒有對應(yīng)關(guān)系。前三個餾分4-松油醇含量低，w分別是18.76%、17.66%和22.56%，但抑菌活性好；后兩個餾分4-松油醇含量很高，w分別是28.90%和36.95%，抑菌活性卻很差。觀察α-松油醇的含量與抑菌活性的關(guān)系，結(jié)論同上。對傘花烴對抑菌活性的貢獻(xiàn)似乎也不占主導(dǎo)地位。餾分(3)含對傘花烴w=22.64%，抑菌活性不如含16.05%的餾分(2)；而含對傘花烴13.75%的餾分(4)并沒有抑菌活性。從α-松油烯的數(shù)據(jù)同樣看不出其對抑菌活性的貢獻(xiàn)。由此可以認(rèn)為，茶樹油的抑菌作用與α-松油烯、對傘花烴、γ-松油烯和4-松油醇的含量沒有直接關(guān)系。

茶樹油的抑菌活性物質(zhì)只能從非主要成分中尋找。其中最有關(guān)聯(lián)度的是1,8-桉葉素[12]。餾分(1),(2),(3)中1,8-桉葉素含量w分別為6.83%、6.43%和6.44%，這三個餾分都表現(xiàn)出很好的抑菌活性；餾分(4)中1,8-桉葉素w為1.45%，比前三種餾分低得多，相應(yīng)的抑菌活性也差得多，餾分(5)檢不出1,8-桉葉素，也沒有抑菌活性。

表5 廣東從化茶樹油各餾分化學(xué)成分分析結(jié)果(1)

表6 廣東從化茶樹油各餾分的抑菌圈直徑(1)和最小抑菌濃度

表7 從廣東化茶樹油各餾分中主要化學(xué)成分的變化1)

3 結(jié) 論

廣西玉林、江西吉安和廣東從化三個地方出產(chǎn)的茶樹油成分存在較大差異。廣西玉林茶樹油1,8-桉葉素w高達(dá)72.49%，4-松油醇w只有0.78%，屬于桉型茶樹油。廣東從化茶樹油的4-松油醇w為43.59%、1,8-桉葉素w只有2.14%，保留澳洲茶樹油的成分特征，屬于松油醇型茶樹油。江西吉安茶樹油是一種幾乎不含4-松油醇，但α-松油醇w達(dá)到23.77%、1,8-桉葉素w提高到20.17%的茶樹油，可能又是一種新類型。

雖然三種茶樹油品種不同，但是對兩種供試菌種都有較強(qiáng)的抑菌活性。廣西玉林茶樹油對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.66 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到22.33 mm；江西吉安茶樹油對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到19.86 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到25.47 mm；廣東從化茶樹油對大腸桿菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.35 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達(dá)到26.51 mm。

實驗數(shù)據(jù)表明,三種茶樹油的有效抑菌物質(zhì)都是1,8-桉葉素。而4-松油醇、γ- 松油烯、α-松油烯和傘花烯等物質(zhì)對1,8-桉葉素的抑菌效果有協(xié)同作用。

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