周春和 高玉華 高社光 王玲玲 宋立峰 申煒 郭興芳 李志斌 劉娜

潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因不明的反復(fù)發(fā)作的慢性非特異炎癥性腸道疾病。目前普遍認(rèn)為其發(fā)病與免疫功能紊亂有關(guān)[1-3]，因此具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子在其發(fā)病過程中起著不可忽視的作用。筆者采用椒梅連理湯治療該病，療效顯著。為進(jìn)一步研究該方發(fā)生作用的機(jī)理，制作潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，以椒梅連理湯作為處理因素，觀察其對模型大鼠細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級SD大鼠43只，體重(220±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后按體重順序編碼，用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為4組：正常組10只，模型組、柳氮磺胺吡啶組(SASP組)、椒梅連理湯組(中藥組)各11只。

1.2 試劑與器材

5%三硝基苯磺酸(TNBS)溶液由美國Sigma公司生產(chǎn)。水合氯醛為國產(chǎn)分析純。無水乙醇。白介素1β(IL-1β),白介素4(IL-4)，白介素6(IL-6)試劑盒，大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫雙抗體夾心(ABC-ELISA)試劑盒，由北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司提供。日立高速冷凍離心機(jī)。奧林巴斯雙目光學(xué)顯微鏡。

1.3 造模方法

正常組不造模，其余3組于造模前禁食48小時，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠尾部抬高，約呈40°角，將5%三硝基苯磺酸(TNBS)與無水乙醇以2∶1的體積混合，將一外徑2.0 mm輸液管緩慢從大鼠肛門插入約8 cm，緩慢灌注以上混合液0.6 ml，捏緊肛門放置5分鐘，等待大鼠自然蘇醒。造模結(jié)束后第2天各造模組隨機(jī)處死1只大鼠，肉眼觀察其結(jié)腸情況，并取8 cm腸段做HE染色，光鏡下觀察，確定造模成功。

1.4 藥物及給藥方法

造模后3天開始給藥，連續(xù)4周。椒梅連理湯組(中藥組)予中藥灌胃，由邯鄲市中醫(yī)院中藥房提供。椒梅連理湯組成：川花椒6 g、烏梅15 g、川黃連15 g、黨參12 g、麩炒白術(shù)15 g、干姜6 g、炙甘草10 g。加10倍量水煎煮，濃縮，按成人用量的8倍量，灌胃容積為1 ml/100 g體重，每天1次。

柳氮磺胺組(SASP組)予柳氮磺胺混懸液灌胃。柳氮磺胺吡啶片由上海三維制藥有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H31020450。將其研磨成細(xì)粉，使用時用蒸餾水配成混懸液，按0.267 g/kg，灌胃容積為1 ml/100 g體重(相當(dāng)于成人用量的8倍)，每天1次。

正常組及模型組給予蒸餾水，按1 ml/100 g體重灌胃，每天1次。

1.5 觀察指標(biāo)

所有動物均飼養(yǎng)4周，觀察記錄大鼠糞便、毛發(fā)、精神等一般狀況。取材前禁食水12小時，10%水合氯醛麻醉，開腹，腹主動脈取血，靜置2小時，3000 rpm離心10分鐘，取血清備用。肉眼觀察大鼠結(jié)腸形態(tài)，肛門以上8 cm剪取病變最明顯處結(jié)腸段，取組織100 mg加入生理鹽水1 ml，研磨制作成勻漿，于4 ℃ 3000 rpm離心取上清液備用。放射免疫分析法測定各組血清及組織勻漿IL-1β、IL-4、IL-6含量，ELISA法測定TNF-α含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況

模型組動物精神萎靡，活動減少，毛發(fā)干枯無光澤，顏色發(fā)黃，進(jìn)食減少，排稀便，部分帶有膿液或黏液血便，肛周污穢。SASP組和中藥組大鼠在第1周同模型組，第2～3周逐漸好轉(zhuǎn)，第4周時精神好轉(zhuǎn)，活動較多，毛發(fā)比較光亮，糞便基本恢復(fù)正常。

2.2 大鼠結(jié)腸黏膜損傷大體情況

肉眼觀察模型組結(jié)腸黏膜充血、水腫，黏膜表面有膿血黏液。可見局部糜爛，或局部有橢圓形淺表潰瘍，潰瘍間黏膜水腫而增厚，某些病變區(qū)域顏色黑褐。SASP組和中藥組較模型組充血水腫不明顯，結(jié)腸黏膜顏色與正常組相似，未見明顯潰瘍。

2.3 對大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-6及TNF-α的影響

模型組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量較正常組顯著升高(P<0.05)，中藥組及SASP組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量則顯著低于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組IL-4含量較正常組降低(P<0.05)，中藥組及SASP 組含量高于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.4 對大鼠結(jié)腸黏膜組織中IL-1β、IL-4、IL-6及TNF-α的影響

模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量較正常組升高(P<0.05) ；中藥組及SASP 組含量低于模型組(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組IL-4低于正常組(P<0.05)，中藥組及SASP 組含量較模型組升高(P<0.05)，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2。

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制之一可能是由于腸黏膜通透性增加，導(dǎo)致腸腔內(nèi)特異性抗原進(jìn)入黏膜下肌層，引起的結(jié)腸損傷?；谝陨侠碚?，采用TNBS和乙醇混合造模，乙醇破壞腸黏膜屏障，輔助TNBS進(jìn)入腸黏膜而致炎。本研究顯示造模后動物出現(xiàn)排稀便、膿液和黏液血便等，病理檢查示結(jié)腸潰瘍、腸壁充血水腫、炎性細(xì)胞滲出等，與潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床表現(xiàn)和病理變化類似。因此筆者認(rèn)為采用該方法造模成功。

IL-1主要有IL-α和IL-β兩種形式，其中IL-β主要為分泌型的。它的分泌可介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎的早期的炎癥反應(yīng)。它能夠促進(jìn)炎癥活性，刺激其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，增加單核-巨噬細(xì)胞等的抗原提呈能力，促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，介導(dǎo)免疫球蛋白的分泌，激活補(bǔ)體和殺傷細(xì)胞等的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫。IL-6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，也是一種促炎癥因子，它與其他細(xì)胞因子一起，可通過誘導(dǎo)T細(xì)胞活性，促進(jìn)炎癥的發(fā)生，參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病與遷延。其升高程度與局部炎癥程度相一致。IL-4主要由活化的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌，有研究表明IL-4可以抑制單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-β和TNF-α，具有抑制炎癥的作用，可以緩解炎癥。正常人黏膜的淋巴細(xì)胞比外周血淋巴細(xì)胞分泌更多的IL-4， 也表明其對于維持腸道的免疫功能起著重要的作用[1-2]。TNF-α 是公認(rèn)的能介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的細(xì)胞因子之一，與T淋巴細(xì)胞及其他一些細(xì)胞因子構(gòu)成復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。它主要通過使中性粒細(xì)胞聚集、內(nèi)皮粘附分子上調(diào)、凝血酶原效應(yīng)等參與UC 的發(fā)病，還可通過激活轉(zhuǎn)錄因子核因子kB通路，上調(diào)IL-6等促炎介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生與遷延[3]。

表1 椒梅連理湯對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-α的影響

本研究顯示模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平較正常組明顯升高，IL-4水平較正常組降低，說明模型大鼠存在炎性細(xì)胞因子(促炎因子與抗炎因子)的失衡，經(jīng)治療后，IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，IL-4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明中藥和SASP均能調(diào)整炎性因子水平，糾正其失衡狀態(tài)，從而改善腸道炎癥，起到抗炎，修復(fù)潰瘍損傷的作用，兩者作用相當(dāng)。李楠等[4]研究也有相類似的結(jié)果，復(fù)方血竭能抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-1β、IL-6水平，上調(diào)IL-4和IL-10水平。

潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病有因情志不暢，或飲食不節(jié)致邪滯于腸，氣血壅滯，腸道傳導(dǎo)失司，脂絡(luò)受傷，腐敗化為膿血或素體陰盛，外感寒濕，內(nèi)傷飲食，遷延日久，脾虛濕盛、寒熱夾雜之證[5]。常因過勞、受冷或飲食不節(jié)而加重。治療寒熱并調(diào)為主，并健脾祛濕。本研究自擬椒梅連理湯治療，方中川花椒、烏梅、黃連助陽益腎，調(diào)節(jié)寒熱；黨參可以益氣健脾，麩炒白術(shù)可以燥濕健脾，干姜溫中散寒，炙甘草和中緩急，以達(dá)到溫運(yùn)脾濕、調(diào)和寒熱的作用。諸藥合用，對潰瘍性結(jié)腸炎有較好的療效。

本研究結(jié)果提示椒梅連理湯能有效對抗實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎，與SASP相當(dāng)，通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4含量，調(diào)整炎性因子，糾正機(jī)體異常免疫功能，消除炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)，可能是其治療機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)

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[4] 李楠，王雪明，翟俊山，等.復(fù)方血竭對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型結(jié)腸組織細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008,14(1)：377-379.

[5] 朱潔梅，李春婷.中藥內(nèi)治潰瘍性結(jié)腸炎淺議[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2011，4(1)：43-45.