朱雄偉，熊 瑤，蘇騰甲

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，綠色化工過程省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074)

0 引 言

半乳糖醛酸是植物細(xì)胞間質(zhì)中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和多聚半乳糖醛酸的組成成分，是多糖類的物質(zhì)，以多聚體的形式存在于纖維素、半纖維素木質(zhì)素和多聚半乳糖醛酸中.而纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、多聚半乳糖醛酸是難降解的物質(zhì)[1-2].在造紙廢水和食品工業(yè)廢水中，它們的存在對廢水的處理增加了很大的難度，如果降解了它們組成中的多聚半乳糖醛酸，對降解廢水中這些難降解物質(zhì)就非常有利.

筆者從含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的廢水池和食品工業(yè)的廢水池中篩選分離得到一株能有效降解多聚半乳糖醛酸的菌株.經(jīng)過前期研究，在食品工業(yè)廢水中篩選的菌株降解能力強(qiáng)，并在以上兩種廢水環(huán)境生存能力強(qiáng)，以此菌株為研究菌株，通過16S rRNA的鑒定，此菌株屬細(xì)菌類，初步命名為HDYM-02.為了進(jìn)一步提高菌株降解多聚半乳糖醛酸的能力，我們對其作進(jìn)一步誘變處理，雖然誘變育種方法產(chǎn)生的是不定向變異，但誘變結(jié)果相對于單純的純培養(yǎng)選育均有較大的突變率.菌株通過合適的誘變，能更好地選育出產(chǎn)降解能力更強(qiáng)、菌株性質(zhì)更穩(wěn)定、針對性更強(qiáng)的新菌株[3].本研究通過三種誘變劑(硫酸二乙酯、疊氮鈉、馬來酰肼)和紫外線對此菌株進(jìn)行誘變，從誘變菌株中進(jìn)行篩選，選育出更好的菌株.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

1.1.1 菌株及保存條件 以從食品工業(yè)廢水池中篩選的具有降解多聚半乳糖醛酸菌株HDYM-02為研究菌株，在瓊脂斜面保藏培養(yǎng)基上傳代，4 ℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 試劑與儀器 0.1%的剛果紅染色試劑；DNS試劑； 0.85%生理鹽水；pH 7.0磷酸緩沖液；多聚半乳糖醛酸(美國Sigma公司生產(chǎn))；硫酸二乙酯；疊氮鈉；馬來酰肼；紫外燈；紅外燈；電子天平；2001 型振蕩慍溫培養(yǎng)箱；水平離心機(jī)；立式壓力蒸汽滅菌鍋；島津紫外UV-1800分光光度計(jì).

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：多聚半乳糖醛酸0.5%(為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%；液體培養(yǎng)基：多聚半乳糖醛酸0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%；多聚半乳糖醛酸瓊脂培養(yǎng)基：多聚半乳糖醛酸0.2%，瓊脂2%.

1.2 方 法

1.2.1 菌體收集 將多聚半乳糖醛酸酶生產(chǎn)菌株HDYM-02，在固體培養(yǎng)基上于35 ℃培養(yǎng)12 h，待菌落長出后接入液體培養(yǎng)基，35 ℃下 120 r/min搖床培養(yǎng)48 h.將菌體培養(yǎng)液3 500 r/min離心15 min收集菌體，pH 7.0的磷酸緩沖溶液洗滌離心三次，備用.

1.2.2 誘變方法[4]a. 硫酸二乙酯誘變：取3份菌懸液分別標(biāo)記I、II、III，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%硫酸二乙酯溶液0.2 mL，I號誘變處理60 min，II號誘變處理30 min，III號誘變處理10 min.誘變結(jié)束后立即使用pH 7.0磷酸緩沖溶液稀釋、并離心洗滌三次.稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

b. 疊氮鈉誘變：取3份菌懸液分別編號為IV、V、VI，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%疊氮鈉溶液0.2 mL，IV號誘變處理60 min，V號誘變處理30 min，VI號誘變處理10 min.誘變結(jié)束后立即使用pH 7.0磷酸緩沖溶液稀釋、并離心洗滌三次.稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

c. 馬來酰肼誘變：取3份菌懸液分別編號為VII、VIII、IX，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%馬來酰肼溶液0.2 mL，VII號誘變處理60 min，VIII號誘變處理30 min，IX號誘變處理10 min.誘變結(jié)束后立即使用pH 7.0磷酸緩沖溶液稀釋、并離心洗滌三次.稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

d. 紫外誘變[5]：取3份菌懸液分別編號為X、XI、XII，將菌懸液置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，X、XI、XII號培養(yǎng)皿放置在磁力攪拌器載物臺上，先開啟紫外燈(18 W，距離24 cm)預(yù)熱30 min，然后開啟攪拌器，打開皿蓋開啟紫外燈照射，X號處理0 s，XI號處理30 s，XII號處理60 s.稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，整個操作需要紅光下進(jìn)行.

1.2.3 突變菌株的篩選a. 剛果紅染色法篩選：多聚半乳糖醛酸酶產(chǎn)生菌誘變育種的篩選方法很多，報道較多的是透明區(qū)帶法.本研究使用的是剛果紅染色法.將經(jīng)過紫外及三種化學(xué)誘變劑(硫酸二乙酯、疊氮鈉、馬來酰肼)誘變得到的菌株分別置于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將培養(yǎng)皿編號I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII，35 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，待菌落長出后，于其上鋪多聚半乳糖醛酸瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的剛果紅染色15 min，用生理鹽水沖洗至無紅色水流出，放于冰箱中過夜.次日觀察，有多聚半乳糖醛酸分解能力的菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明圈.用游標(biāo)卡尺測量透明圈直徑(H)以及菌落的直徑(C)，計(jì)算H/C值.計(jì)算出上述12個平板中的H/C值，比值大的說明多聚半乳糖醛酸分解能力強(qiáng).

b. 降解能力的測定：本研究測定降解半乳糖醛酸能力的方法是DNS比色法，是一種比較簡單易行的方法.多聚半乳糖醛酸徹底水解后變?yōu)榘肴樘侨┧?；半乳糖醛酸可與DNS試劑在一定條件下發(fā)生顏色反應(yīng).反應(yīng)的結(jié)果可以用分光光度計(jì)在540 nm波長處檢測出來，據(jù)此可得出菌株降解多聚半乳糖醛酸的能力.取適量發(fā)酵液置于15 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，提取上清液.質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%多聚半乳糖醛酸溶液1.0 mL，50 ℃預(yù)熱3 min，加上清液0.2 mL混合，50 ℃水解10 min，加DNS試劑3 mL，混合后于沸水浴中10 min，冷卻定溶15 mL.并用等量的煮沸過的上清液0.2 mL空白調(diào)零，540 nm下測定吸光度值[6].

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸二乙酯誘變處理

2.1.1 剛果紅染色法篩選[7]將硫酸二乙酯誘變得的菌株I、II、III，對菌株進(jìn)行剛果紅染色，得到菌株I、II、III的H/C.如表1所示.

表1 硫酸二乙酯誘變菌株的H/C值Table 1 H/C value of strains by ethyl methanessulfonate mutation

由表1可知,菌株I、II、III的H/C值都有所增加，提高最大的是菌株II，提高百分率可達(dá)52.9%.

2.1.2 硫酸二乙酯誘變菌株降解能力的測定 將硫酸二乙酯誘變得的菌株I、II、III[8]，分別測定菌株I、II、III降解能力的相對值.如表2所示.

表2 硫酸二乙酯誘變菌株降解能力Table 2 Degradation ability of strains by ethyl methanessulfonate mutation

由表2可知,菌株II、III的酶活力都有所增加，提高最大的是菌株II，此菌株的降解能力是出發(fā)菌株的1.39倍.

2.2 疊氮鈉誘變處理

2.2.1 剛果紅染色法篩選 將疊氮鈉誘變得的菌株IV、V、VI，對菌株進(jìn)行剛果紅染色[9]，得到菌株IV、V、VI的H/C.如表3所示.

表3 疊氮鈉誘變菌株的H/C值Table 3 H/C value of strains by sodium azide mutation

由表3可知,菌株V、VI的H/C值都有所增加，提高最大的是菌株V，提高百分率可達(dá)61.7%.

2.2.2 疊氮鈉誘變菌株降解能力的測定 將疊氮鈉誘變得的菌株IV、V、VI[10]，分別測定菌株IV、V、VI降解能力的相對值.如表4所示.

表4 疊氮鈉誘變菌株降解能力Table 4 Degradation ability of strains by sodium azide mutation

由表4可知,菌株V、VI的降解能力都有所增加，提高最大的是菌株V，此菌株的降解能力是出發(fā)菌株的1.60倍.

2.3 馬來酰肼誘變處理

2.3.1 剛果紅染色法篩選 將馬來酰肼誘變得的菌株VII、VIII、IX[11]，對菌株進(jìn)行剛果紅染色，得到菌株VII、VIII、IX的H/C.如表5所示.

表5 馬來酰肼誘變菌株的H/C值Table 5 H/C value of strains by maleic hydrazide mutation

由表5可知,菌株VII、VIII、IX的H/C值都有所增加，提高最大的是菌株VIII，提高百分率可達(dá)45.9%.

2.3.2 馬來酰肼誘變菌株降解能力的測定 將馬來酰肼誘變得的菌株VII、VIII、IX[12]，分別測定菌株VII、VIII、IX降解能力的相對值.如表6所示.

表6 馬來酰肼誘變菌株降解能力Table 6 Degradation ability of strains by maleic hydrazide mutation

由表6可知,菌株VIII、IX的降解能力都有所增加，提高最大的是菌株VIII，此菌株的降解能力是出發(fā)菌株的1.24倍.

2.4 紫外誘變處理

2.4.1 剛果紅染色法篩選 紫外誘變得的菌X、XI、XII[13]，對菌株進(jìn)行剛果紅染色，得到菌株X、XI、XII的H/C.如表7所示.

由表7可知,由于菌株X紫外誘變的時間為0 s，相當(dāng)于沒有誘變，故其與出發(fā)菌株相同.菌株XI、XII的H/C值都有所增加，提高最大的是菌株XII，提高百分率可達(dá)37.7%.

2.4.2 紫外誘變菌株降解能力的測定 將紫外誘變得的菌株X、XI、XII，分別測定菌株X、XI、XII降解能力的相對值.如表8所示.

表8 紫外誘變菌株降解能力Table 8 Degradation ability of strains by ultraviolet light mutation

由表8可知,菌株XI、XII的降解能力都有所增加，提高最大的是菌株XII，此菌株的降解能力是出發(fā)菌株的1.33倍.

3 結(jié) 語

本研究使用三種化學(xué)誘變劑(硫酸二乙酯、疊氮鈉、馬來酰肼)及紫外對分離篩選得到的降解多聚半乳糖醛酸生產(chǎn)菌株HDYM-02進(jìn)行誘變，得到多個誘變菌株，并使用剛果紅染色法篩選誘變菌株，測定它們的降解能力[14-15].結(jié)果表明，出發(fā)菌株經(jīng)過疊氮鈉誘變30 min時，誘變得到的菌株降解能力最高，是出發(fā)菌株酶活力的1.66倍，誘變得到的菌株降解效率高，符合人們的生產(chǎn)需要.

參考文獻(xiàn)：

[1] 張樹政.酶制劑工業(yè)[M]. 下冊.北京:科學(xué)出版社,1984:233-236.

[2] 李拖平,李蘇紅.山楂果膠中多聚半乳糖醛酸多糖的化學(xué)構(gòu)造特征[J].食品科學(xué),2008,29(10): 37-40.

[3] 董章勇,王振中.真菌多聚半乳糖醛酸酶的研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,38(18): 125-127.

[4] 施巧琴.工業(yè)微生物育種學(xué)[M]. 3版.北京:科學(xué)出版社,2003:35-60.

[5] 杜國軍,劉曉蘭.產(chǎn)果膠酶黑曲霉的篩選及誘變育種[J].農(nóng)業(yè)與技術(shù),2008,28(2)：68-70.

[6] 蘇騰甲,朱雄偉，張佑紅，等.果膠酶生產(chǎn)菌株的分離及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].武漢工程大學(xué)學(xué)報,2012,34(4):15-18.

[7] 張智維,楊輝.He-Ne激光誘變選育果膠酶高產(chǎn)菌[J].食品工業(yè)科技,2006,27(10):156-157.

[8] 由田,宋剛.果膠酶高產(chǎn)菌株的紫外線及硫酸二乙酯的誘變育種[J]. 微生物學(xué)雜志,2011,31(5):69-72.

[9] Jayani R S, Saxena S, Guptar R. Microbial pectinolytlc enzymes:a review [J]. Process Biochemistry, 2005,40: 2931-2944.

[10] Xu W, Jameson D, Tang B. The relationshipbetween the rate of motecular evolution and the rate of genome rearrangement in animal mitochondrial genomes [J]. Journal of molecular evolution, 2006, 63(3): 375-392.

[11] Chiara V, Michela J, Vincenzo L.The Ectopic Expression of a Pectin Methyl Esterase Inhibitor Increases Pectin Methyl Esterification and Limits Fungal Diseases in Wheat[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions,2011,24(9):1012-1019.

[12] Cascales I R, García J M, Roca J M. The effect of a commercial pectolytic enzyme on grape skin cell wall degradation and colour evolution during the maceration process[J]. Food Chemistry,2012,130(3):626-631.

[13] Wilde H D, Chen Y H, Jiang P. Anjanabha Bhatt-acharya.Targeted mutation breeding of horticultural plants[J]. Emirates Journal of Food and Agriculture,2012,24(1):31-41.

[14] Shahab S, Hoveize M S. Mutation induction using ethyl methanessulfonate(EMS) in regenerated plantlets of two verieties of sugarcane CP48-103 and CP57-614[J]. African Journal of Agricultural Research, 2012,7(8):1282-1288.

[15] Sridevi A , Mullainathan L. Effect of gamma rays and ethyl methane sulphonate(EMS) in M3 generation of blackgram (Vigna mungo L. Hepper) [J]. African Journal of Biotechnology,2012,11(15):3548-3252.