胡丹丹 陳 偉 孫 鑫

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200030）

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、休克等多種應(yīng)激狀態(tài)下的常見(jiàn)并發(fā)癥，發(fā)病率高，死亡率高。膿毒癥死亡與其易導(dǎo)致多臟器功能損傷有密切關(guān)系。膿毒癥中醫(yī)辨證多從毒、瘀、痰入手，但在膿毒癥心肌損傷時(shí)患者多表現(xiàn)為毒熱神昏，治療當(dāng)以醒神開(kāi)竅祛除瘀毒。因此，本研究以大鼠盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥模型，觀察醒腦靜注射液對(duì)膿毒癥大鼠的心臟保護(hù)效應(yīng)，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物雄性 Wistar大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。造模前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 主要儀器低溫離心機(jī) （Eppendorf Centrifuge 5804德國(guó)）；紫外分光光度計(jì)（BECKMANDU-600，美國(guó)）；電泳轉(zhuǎn)膜裝置（Bio-RAD，美國(guó)）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（泰州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司）；Model 550 酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國(guó)）；Bio Sen SC300 凝膠圖象分析系統(tǒng)（上海山富科學(xué)儀器有限公司）；PTC-225 Peltier Thermal Cycler（MJ Research Inc，Waltham，Massachusetts）；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler （Corbett Reseach，Sydney，Australia）等。

1.3 藥物與試劑醒腦靜注射液（無(wú)錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z32020563）。戊巴比妥鈉（上海西塘生物科技有限公司）。氯仿，異丙醇，二硫代蘇糖醇（DTT）（0.1 mol/L），RNasin（40 U/μL），dNTP（10 mmol/L），隨機(jī)引物，D NaseI（5 U/μL），逆轉(zhuǎn)錄酶，SYBRI，50×Calibration，HS ExTaq 酶及 10×Buffer等；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（煙臺(tái)賽爾斯公司）；Light Shift化學(xué)發(fā)光凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）試劑盒（Pierce，美國(guó)）；核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒（天根生化科技有限公司）；Trizol Reagent（Invitrogen，美國(guó)）。

1.4 模型制備參照文獻(xiàn)［1］報(bào)道以CLP法制備膿毒癥模型。

1.5 分組及給藥大鼠分為6組：正常組、假手術(shù)組、模型6 h組、模型24 h組、醒腦靜6 h組及醒腦靜24 h組，每組8只。正常組與其余各組同步飼養(yǎng)，麻醉后腹主動(dòng)脈采血處死；模型6 h組、醒腦靜6 h組行CLP術(shù)后，分別尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg、醒腦靜注射液5 mL/kg；模型24 h組、醒腦靜24 h組行CLP術(shù)后，分別于0、6、12 h尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg、醒腦靜注射液5 mL/kg。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè)模型6 h組、醒腦靜6 h組和模型24 h組、醒腦靜24 h組分別于CLP術(shù)后6、24 h麻醉并腹主動(dòng)脈采血處死留取標(biāo)本行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。假手術(shù)組麻醉后開(kāi)腹翻動(dòng)腸道，關(guān)腹，24 h后麻醉，腹主動(dòng)脈采血處死，留取標(biāo)本行相關(guān)檢測(cè)。（1）使用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）。（2）ELISA 檢測(cè)心肌組織 TNF-α 蛋白含量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。（3）熒光定量PCR（PT-PCR）法檢測(cè)心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)。Trizol常規(guī)法抽提各組心肌組織總RNA，去除基因組DNA；RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；引物TNF-α：5＇–TCCTTCAGACACCCTCAACC-3＇；3＇-AGGCCCCAGT TTGAATTCTT-5＇，GAPDH：5＇-GAGTCAACGGA TTTGGTCGT-3＇；3＇-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-5＇。 取樣本總 cDNA 1 μL、上游和下游引物各0.5 μL，加入試劑盒其他成分，樣品TNF-α、GAPDH循環(huán)條件為：94℃預(yù)變性5 min；接著進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，95℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 40 s；最后 72℃延伸5 min。將預(yù)試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物以10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，選擇1/10000，1/100000，1/1000000，1/10000000 濃度的稀釋產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)并同時(shí)在熒光定量PCR儀中輸入以上4個(gè)濃度梯度的數(shù)值。通過(guò)這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品生成的反應(yīng)數(shù)據(jù)，軟件Rotor-Gene6.0根據(jù)反應(yīng)的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度關(guān)系，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算在標(biāo)準(zhǔn)曲線所劃定的CT值。以GADPH為內(nèi)參，計(jì)算目的基因與GADPH的比值，比值即為擴(kuò)增產(chǎn)物定量相對(duì)值。（4）EMSA法檢測(cè)心肌組織NF-κB活性。按核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取核蛋白，Bradford法測(cè)定核蛋白濃度。 核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的探針序列：生物化標(biāo)記，5'-AGTTGAGGGGA CTTTCCCAGGC-3'；3'-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5'。按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)要求操作，配制20μL檢測(cè)結(jié)合反應(yīng)體系，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，固定，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)生物素標(biāo)記DNA，X線下曝光顯影，用分析軟件將圖片上的特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用簡(jiǎn)單線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌酶譜變化見(jiàn)表1。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6 h組心肌組織CK-MB、CK均較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織CK-MB、CK均較模型6 h組、醒腦靜6 h組明顯升高（P＜0.05或0.01）；模型24 h組心肌組織CK-MB、CK水平高于醒腦靜24 h組（P＜0.05）；模型6 h組心肌組織CK-MB、CK水平高于醒腦靜6 h組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠心肌酶CK-MB、CK比較（U/L，±s）

表1 各組大鼠心肌酶CK-MB、CK比較（U/L，±s）

與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n CK-MB CK正常組 8 2083.10±659.52 1001.87±254.07假手術(shù)組 8 2199.35±559.58 1195.40±248.37模型 6 h組 8 3230.85±644.83△ 1774.72±505.86△醒腦靜 6 h組 8 2578.88±532.98*△ 1331.58±309.94*△模型 24 h組 6 4218.55±384.55△△ 3234.75±569.31△△醒腦靜 24 h 組 6 3559.27±345.67*△△ 1969.45±542.61*△△

2.2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平變化見(jiàn)表2。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組 （P＜0.05或0.01），模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達(dá)均較模型6 h組、醒腦靜6 h組降低（P＜0.05）；醒腦靜24 h組心肌組織TNF-α含量及TNF-α mRNA表達(dá)低于模型24 h組 （P＜0.05）；醒腦靜 6 h組心肌組織 TNF-α含量及TNF-α mRNA 表達(dá)低于模型 6 h組（P＜0.01）。

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較（±s）

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α水平比較（±s）

組 別 n TNF-α蛋白含量（ng/mL） TNF-α mRNA表達(dá)正常組 8 12.6808±0.8651 1769.1078±172.0320假手術(shù)組 8 13.4787±2.2911 2018.1289±174.1766模型 6 h組 8 23.8726±2.0491△△ 19840.8051±1169.1709△△醒腦靜 6 h組 8 18.1155±3.3767**△ 16816.4239±367.6749**△△模型 24 h組 6 20.2241±1.1088△△ 5772.4474±418.5459△醒腦靜 24 h組 6 16.7476±2.3094*△ 3560.0677±418.5459*△

2.3 各組大鼠心肌組織NF-κB表達(dá)變化見(jiàn)表3，圖1。模型24 h組、醒腦靜24 h組、模型6 h組、醒腦靜6h組心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)均高于假手術(shù)組（P＜0.05或0.01），模型24 h組、醒腦靜24 h組心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)均較模型6 h組、醒腦靜 6 h組降低（P＜0.05）；醒腦靜24 h組心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)低于模型24 h組（P＜0.05）；醒腦靜6 h組心肌組織NF-κB蛋白表達(dá)低于模型6 h組（P＜0.01）。

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB活性比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織NF-κB活性比較（±s）

組 別 n NF-κB正常組 8 2895.1217±161.9397假手術(shù)組 8 3192.9800±643.0317模型 6 h 組 8 5589.6167±348.8476△△醒腦靜 6 h 組 8 4120.2967±302.7574**△△模型 24 h 組 6 4476.6033±211.9653△醒腦靜 24 h 組 6 3801.7850±424.2036*△

圖1 各組NF-κB活性變化

2.4 心肌酶與TNF-α、NF-κB相關(guān)性分析線性回歸分析示：各組大鼠 CK、CK-MB與各組心肌組織 TNF-α蛋白、TNF-α mRNA表達(dá)及NF-κB活化呈正相關(guān)（P＜0.01）；心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)和TNF-α蛋白合成成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.674（P＜0.01）；TNF-α蛋白合成水平和NF-κB活性改變成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù) r為 0.732 （P＜0.01）； 而 NF-κB活性改變與 TNF-α mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r為0.682（P＜0.01）。

3 討 論

對(duì)于膿毒癥的發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)較公認(rèn)的涉及內(nèi)毒素釋放、細(xì)胞因子分泌異常、凝血通路異常、基因多態(tài)性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常等因素，但最與臨床符合的為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放異常，繼而導(dǎo)致器官損傷。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中研究最為廣泛的為NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路。NF-κB廣泛存在于多種細(xì)胞，參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，能與許多細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的基因啟動(dòng)子區(qū)域的固定核苷酸序列結(jié)合，啟動(dòng)TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6等細(xì)胞因子的基因表達(dá)，調(diào)控NF-κB活性及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能有效抑制多種炎癥介質(zhì)的超量釋放，阻止失控的炎癥反應(yīng)，對(duì)膿毒癥的治療具有重要意義。因此本研究觀察了NF-κB表達(dá)及其下游細(xì)胞因子表達(dá)的情況，通過(guò)對(duì)該通路的觀察了解醒腦靜注射液對(duì)抗膿毒癥心肌損害的作用機(jī)制。

膿毒癥患者多因久病體衰，或外傷卒病，致使機(jī)體正氣不足，氣血陰陽(yáng)失衡，衛(wèi)外不固，令邪毒有內(nèi)侵之機(jī)。外來(lái)之毒擾亂機(jī)體正常代謝及功能，入里化熱，變生熱毒；熱毒煎熬血液，加之氣虛無(wú)以行血，則血流瘀滯，津液?；癁樘禎幔緹?、瘀血、痰濁等內(nèi)生之毒隨之而生；內(nèi)外之毒相互蘊(yùn)結(jié)，阻遏三焦氣機(jī)，灼傷氣陰及脈絡(luò)，臟真受損，機(jī)體陰陽(yáng)氣血逆亂，內(nèi)生更多毒邪，形成惡性循環(huán)。因此，清熱解毒以祛除外來(lái)、內(nèi)生之毒邪，是治療膿毒癥的核心環(huán)節(jié)之一。醒腦靜注射液由安宮牛黃丸經(jīng)減味而成，主要成分為麝香、冰片、梔子，具有清熱瀉火，涼血解毒之效。既往研究表明其能抑制TNF-α、IL-6和IL-1表達(dá)［2］，減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的膿毒癥肺損傷［3］，但未對(duì)膿毒癥心肌損傷進(jìn)行研究，也未進(jìn)一步從炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行深入機(jī)制研究。本研究數(shù)據(jù)顯示，CLP術(shù)后，模型6 h組CK-MB、CK均出現(xiàn)不同程度的升高，模型24 h組則顯著高于假手術(shù)組和模型6 h組（P＜0.05）。表明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，膿毒癥心肌損害逐漸加重。而醒腦靜6 h組和醒腦靜24 h組心肌酶學(xué)指標(biāo)均較模型組降低，同時(shí)醒腦靜24 h組心肌酶學(xué)低于醒腦靜6 h組，表明隨著醒腦靜的使用，可以減輕細(xì)菌毒素誘導(dǎo)的膿毒癥心肌損害，證明醒腦靜注射液對(duì)膿毒癥心肌損傷具有保護(hù)作用。

本研究顯示膿毒癥大鼠模型6 h組、模型24 h組大鼠心肌組織中TNF-α基因轉(zhuǎn)錄蛋白合成、NF-κB活化均明顯增高，且模型24 h組較模型6 h組上述指標(biāo)明顯升高，這種升高與模型組各組心肌酶學(xué)指標(biāo)升高相似。而在醒腦靜6 h組和24 h組，上述指標(biāo)雖較假手術(shù)組高，但升高程度明顯低于模型6 h組和模型24 h組，證明醒腦靜注射液可以調(diào)控NF-κB信號(hào)通路表達(dá)，進(jìn)一步對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示：TNF-α蛋白合成與NF-κB激活存在正相關(guān)，NF-κB激活與 TNF-α mRNA水平升高亦存在正相關(guān)，而TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄與TNF-α蛋白合成也存在正相關(guān)，并且心肌酶學(xué)改變與TNF-α蛋白、NF-κB激活呈正相關(guān)。提示膿毒癥大鼠在造模后出現(xiàn)的心肌酶學(xué)異常與NF-κB激活，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α蛋白表達(dá)增多有關(guān)。證明醒腦靜注射液可抑制TNF-α，調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而抑制膿毒癥炎癥和免疫反應(yīng)，改善膿毒癥心肌損傷也進(jìn)一步證實(shí)了清熱解毒療法在膿毒癥治療中的作用機(jī)制。

［1］金惠銘.盲腸結(jié)扎穿剌后的大鼠敗血癥模型［J］.中國(guó)病理生理雜志，1990，6（2）：126-128.

［2］陳堅(jiān)，張素平，徐武華，等.醒腦靜注射液對(duì)急性腦出血患者血中細(xì)胞因子水平影響的研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2004，11（4）：224-226.

［3］王進(jìn)，楊光田，喬禮芬，等.醒腦靜注射液對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞核轉(zhuǎn)入因子-κb激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（4）：212-215.