成都地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

李建臻，楊 苗，吳永勝，曹雨辰，許禎瑩，孫越鴻

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川 成都 611134；2.四川省出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，四川 成都 610041）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 自2009年10月～2011年6月，從成都所轄雙流、大邑、邛崍、崇州、新津、金堂等6市（縣）不同的養(yǎng)殖場(chǎng)收集出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，以及有纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎及腦膜炎病變的病死鴨，取其腦、心血、肝臟作為病料，分離細(xì)菌待檢。

1.1.2 試劑 培養(yǎng)基:巧克力瓊脂平板、鮮血瓊脂平板均參照微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（姚火春，2001）自制，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MACC）與腸桿菌科細(xì)菌生化常規(guī)鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、RNase酶、PCR反應(yīng)緩沖體系，瓊脂糖，溴化乙錠，6×Glycerol DNA Loading Buffer，均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑如氯仿、異丙醇、乙醇、NaCl等，均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 參考菌株 RA-JX陽(yáng)性菌株（1型），抗RA的1型血清以及大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌，均由成都市農(nóng)業(yè)職業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物傳染病研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 鴨疫里默氏桿菌（RA）的分離培養(yǎng) 對(duì)疑似RA的病鴨、死鴨進(jìn)行逐一剖檢，詳細(xì)記錄其日齡和病理變化。分別無(wú)菌從病鴨、死鴨的腦、肝臟和心臟采樣劃線接種于兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，將兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基一起置于37℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。挑取只在兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)而不在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的圓形、稍突起、表面光滑、透明的菌落，用兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)。再將純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)和染色特性。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn) 用分離出的純培養(yǎng)物分別作生化試驗(yàn)，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h，每天觀察并記錄結(jié)果一次。

1.2.3 PCR試驗(yàn) 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定:參照楊苗等的方法進(jìn)行，細(xì)菌DNA模板提取采用熱裂解方法。以熱裂解方法提取的細(xì)菌DNA為模板，針對(duì)16SrRNA的特異基因序列設(shè)計(jì)合成引物（由大連寶生物工程公司合成），然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物擴(kuò)增的目的帶片段大小為844bp左右，用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳（80V，40min）EB染色，紫外線下觀察、拍照，分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4 血清型鑒定 參照楊宗維等的方法采用玻片凝集法對(duì)分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。方法如下：取25μL滅菌生理鹽水于滅菌的EP管中，用滅菌接種環(huán)輕輕挑取菌株的純培養(yǎng)物移入EP管并充分搖勻，以調(diào)整至1×109CFU/mL濃度的懸液作為抗原；分別取25μL抗原與25μL抗血清在玻片上混合均勻，室溫靜置，3min內(nèi)判定并記錄結(jié)果；如3min內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀凝集者，則記為陽(yáng)性（+），不出現(xiàn)凝集者記為陰性（-）；同時(shí)將RA的血清I型參考菌株抗原設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，以大腸桿菌、沙門(mén)氏桿菌、PBS液為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 分離株的菌體形態(tài)和菌落培養(yǎng)特征 將RA疑似分離株接種到兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h后，長(zhǎng)出表面光滑、微突起、圓形、閃光透明、奶油狀、直徑為0.5～2.0mm的菌落，在麥康凱平板上不生長(zhǎng)；分離菌株經(jīng)革蘭氏染色證實(shí)為革蘭氏陰性無(wú)芽孢小桿菌，常單個(gè)存在，偶爾呈鏈狀排列。結(jié)果共得到此類細(xì)菌17株。

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果 17株RA分離物均不能發(fā)酵糖，皆能液化明膠（+），17株BS-RA分離物對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶分解都表現(xiàn)為陽(yáng)性，其余各項(xiàng)全為陰性，基本符合RA的特征（見(jiàn)表1）。

2.2 PCR試驗(yàn)結(jié)果 17株RA分離菌株皆擴(kuò)增出844bp的目的條帶，而作為對(duì)照的大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌參考菌株均為陰性，詳見(jiàn)圖1。

表1 RA分離菌株的生化反應(yīng)結(jié)果 株、%

圖1 PCR方法對(duì)RA分離株的檢測(cè)結(jié)果

2.3 血清型鑒定結(jié)果 將經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢查、生化試驗(yàn)、PCR鑒定為RA的17株細(xì)菌分別編號(hào)SL1、SL2、SL3（來(lái)自成都雙流），DY1、DY2、DY3（來(lái)自成都大邑），QL1、QL2、QL3、QL4、QL5 （來(lái)自邛崍），CZ1、CZ2、CZ3（來(lái)自崇州），XJ1、XJ2（來(lái)自新津），JT（來(lái)自金堂），結(jié)果顯示：10個(gè)分離菌株均與RA 1型陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)（SL1、SL2、SL3、DY1、DY2、QL1、QL3、QL4、CZ2、XJ2），其余7株因條件限制，未作進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié)論與分析

3.1 從成都所轄雙流、大邑、邛崍、崇州、新津、金堂等6個(gè)縣（市）的20個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)共69羽RA疑似病例中分離得到了17株細(xì)菌，經(jīng)過(guò)病料觸片染色、細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)鑒定、PCR技術(shù)鑒定等診斷為鴨疫里默氏桿菌感染。其中PCR檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為快速診斷疾病提供了便利，試驗(yàn)中RA菌樣擴(kuò)增出了目的條帶，而大腸桿菌、巴氏桿菌菌樣均未擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明該方法具有特異性。利用PCR技術(shù)進(jìn)行診斷既能保證準(zhǔn)確率，又節(jié)省了時(shí)間。

3.2 用血清1型RA參考菌株標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)所有分離株進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，結(jié)果10個(gè)分離菌株均與RA 1型陽(yáng)性血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，其余7株未定型。17株RA分離株中，有10株為血清1型，占總分離株的58.8%，表明成都地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行以血清1型為主，但至少存在兩種不同的血清型，這與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相符。同時(shí)提示我們，該病有多種血清型混合流行，防治難度有所增加，尤其是用單一菌種疫苗防治該病頗有難度。

[1]楊 苗，程安春.基于鴨疫里默氏桿菌16SrRIVA PCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用 [J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，25（3）：343-347.

[2]楊平東，黃 偉，李 鑫，等.廣東、四川省和重慶地區(qū)鴨傳染性漿膜炎流行病學(xué)調(diào)查 [J].畜牧市場(chǎng)，2010，（5）：21-22.

[3]楊宗維，韋 平，周 祥，等.南寧市商業(yè)肉鴨鴨疫里默氏桿菌病的調(diào)查研究[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2006，25（3）：210-214.