張 榮，杜欣軍，徐桂香，王 菲，王 碩

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

奶牛乳房炎是奶牛乳腺的炎癥反應(yīng)，通常由微生物感染引起。在世界范圍內(nèi)，奶牛乳房炎都是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)最重要的因素之一，并且難以控制[1]。乳房炎對(duì)于奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害包括產(chǎn)奶量下降、牛奶質(zhì)量降低和生產(chǎn)成本增高等[2]。奶牛乳房炎的預(yù)防和控制必須采取持之以恒的綜合性防治措施才有效，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生是控制奶牛乳房炎的基本措施，而利用疫苗來(lái)控制奶牛乳房炎是防治本病的發(fā)展趨勢(shì)。

導(dǎo)致奶牛乳房炎的病原微生物有細(xì)菌、真菌、病毒等，其中以細(xì)菌最為常見(jiàn)[3]。無(wú)乳鏈球菌是奶牛乳腺炎的病原菌，按Lance－field氏血清學(xué)分類(lèi)，無(wú)乳鏈球菌劃歸B群。無(wú)乳鏈球菌為革蘭陽(yáng)性菌，菌體為圓形或卵圓形，直徑約0.6μm～1.2μm，無(wú)鞭毛，無(wú)芽胞，最適生長(zhǎng)溫度為36℃～37℃[4]。

傳統(tǒng)的無(wú)乳鏈球菌莢膜多糖疫苗免疫原性較弱，使其應(yīng)用受到限制[5]，而表面蛋白免疫原性較強(qiáng)，是一種理想的候選疫苗。此外，表面蛋白作為微生物特征性的大分子，具有較高的種屬特異性，是一種理想的免疫檢測(cè)靶標(biāo)。因此，無(wú)乳鏈球菌表面蛋白的研究對(duì)于高效疫苗的研制與免疫檢測(cè)方法的建立具有重要的意義。

Alp蛋白（α－like protein，Alp）是無(wú)乳鏈球菌重要的一類(lèi)表面蛋白，目前已鑒定出α、Rib、R28和Alp2等4種。其中Rib蛋白是從Ⅲ型菌株細(xì)胞壁提取物中分離出的一種高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)（123ku），其純化蛋白質(zhì)的特性與α蛋白有許多相似性，特別是這兩種純化蛋白質(zhì)的N端氨基酸順序有61%是相同的，但在免疫學(xué)性質(zhì)上無(wú)交叉反應(yīng)[6]。Rib蛋白質(zhì)對(duì)胰蛋白酶有耐受性，抗Rib抗體對(duì)Rib菌株所致的感染具有保護(hù)免疫作用[7]。Areschoug T等[8]的研究表明大多數(shù)Ⅲ型菌株和少量的Ⅱ型及Ⅴ型菌株亦能表達(dá)有Rib蛋白質(zhì)。大部分無(wú)乳鏈球菌具有Rib或α蛋白，而且已有研究顯示，如果用Rib和α蛋白一起免疫接種老鼠，不需用佐劑就可以對(duì)大部分無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，因此Rib與α聯(lián)合疫苗與其他疫苗相比有很大優(yōu)勢(shì)[9]。

本研究成功克隆了Rib蛋白N端基因片段，并重組構(gòu)建了rib－pET26b表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以及誘導(dǎo)蛋白表達(dá)獲得了重組蛋白，并以此作為抗原免疫獲得了多克隆抗體，為無(wú)乳鏈球菌疫苗的開(kāi)發(fā)和免疫檢測(cè)方法的建立奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

無(wú)乳鏈球菌ATCC BAA－1176（Ⅲ型）購(gòu)自ATCC公司；胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基（Tryptone soya broth）購(gòu)自O(shè)xiod公司；蛋白酶K、十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris、酚、氯仿、異戊醇（25∶24∶1）、瓊脂糖，均購(gòu)自BBI公司；GoTaq酶購(gòu)自Promega公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將 ATCC BAA－1176菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用基因組DNA提取試劑盒（Tiangen）提取其基因組DNA。

1.2.2 Rib基因擴(kuò)增 以提取到的基因組DNA為模板，利用引物Rib F1（5′－AAGTTTGGTGCAGCTTCTGT－3′）和Rib R1 （5′－TTAGGATTATTATCAATATC－3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，45℃45s，72℃45 s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃10min。取5μL樣品進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用凝膠回收試劑盒（Tiangen）進(jìn)行膠回收。

1.2.3 目的基因的測(cè)序 將膠回收得到的目的基因與pEASY－T1載體連接并測(cè)序。

1.2.4 表達(dá)片段的擴(kuò)增 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)表達(dá)引 物 Rib F2（5′－TACTCAGAATTCGATTGGTATTAGTTTTTTAGG－3′，斜體部分為限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)EcoRⅠ）和 Rib R2（5′－TACTCACTCGAGCTCGTCCCATTTAGGGTCTT－3′，斜體部分為限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)XhoⅠ），以rib－pEASY－T1為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為94℃3min；94℃30s，53℃45s，72℃45s，共進(jìn)行35次循環(huán)；72℃10 min。將擴(kuò)增后的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并進(jìn)行膠回收。

1.2.5 rib－pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建 過(guò)夜培養(yǎng)含有pET－26b的DH5α菌株培養(yǎng)過(guò)夜，提取pet26b質(zhì)粒，將此質(zhì)粒與PCR回收得到的Rib目的基因分別用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，用DNA純化回收試劑盒分別回收后加入T4DNA連接酶連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆。從陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，利用載體引物T7 promoter和T7terminater對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，利用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，加入終濃度為0.1mmol／L的IPTG 37℃誘導(dǎo)5h，SDS－PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果。

1.2.7 Rib蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 由于37℃條件下表達(dá)蛋白不單一，因此在低溫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化。分別選取0.1、0.05、0.01、0.005、0.001mmol／L的IPTG，在20℃條件下誘導(dǎo)12h。為了檢測(cè)蛋白是否形成了包涵體，離心收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，利用SDS－PAGE對(duì)不同條件下的上清液和沉淀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 包涵體變性復(fù)性及純化 首先利用緩沖液A（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，pH 8.0）和緩沖液 B（50mmol／L Tris－HCl，5mmol／L EDTA，2mol／L脲，pH 8.0）分別對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行充分洗滌，然后使用緩沖液 C（0.1mol／L Tris－HCl，10mmol／L DTT，8mol／L脲，pH 8.0）將沉淀懸起，充分混勻，于37℃搖床快搖1h，離心將上清液置于50倍體積透析液（0.1mol／L Tris－HCl，5 mmol／L EDTA，5mmol／L Cysteins，pH 8.0）中透析2d。將透析袋中的復(fù)性蛋白取出離心，上清液與沉淀分別進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)。用His－tag凝膠親和柱（Novagen）純化上清液，步驟按照操作手冊(cè)進(jìn)行，洗脫收集的蛋白用Bradford法測(cè)濃度，SDSPAGE檢測(cè)純化效果。

1.2.9 質(zhì)譜鑒定 將SDS－PAGE凝膠上的目的蛋白條帶切成小塊，用乙腈及胰蛋白酶等處理，完成樣品制備，然后將樣品放入質(zhì)譜儀4700Proteomics Analyzer（ABI），用4000Series及GPS軟件進(jìn)行檢測(cè)，選擇NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白。

1.2.10 Rib多克隆抗體制備 將純化后Rib蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳，切取目的蛋白后，利用液氮充分研磨，溶于9.0g／L NaCl；將0.5mg／mL的抗原1mL與弗式完全佐劑1mL乳化后初次免疫，對(duì)雄性新西蘭大白兔背部進(jìn)行多點(diǎn)皮內(nèi)注射；將0.25 mg／mL的抗原1mL與弗式不完全佐劑1mL乳化后加強(qiáng)免疫，分別于初次免疫后2、4、6周共加強(qiáng)免疫3次，于第3次免疫后7d，從耳緣靜脈處采血，利用間接ELISA方法[9]對(duì)抗血清效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 Rib蛋白基因克隆

以基因組DNA為模板，用基因特異性引物擴(kuò)增目的基因，將此片段與T載體連接后進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)BLAST比對(duì)，與Rib蛋白基因同源性達(dá)到99%。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)表達(dá)引物，擴(kuò)增目的基因，電泳結(jié)果顯示，目的基因在480bp左右，與預(yù)期相符（圖1）。

2.2 rib－pET26b重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將目的片段與pET26b分別酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)DH5α并篩選陽(yáng)性克隆。得到的陽(yáng)性克隆利用PCR和酶切對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖2）。

圖1 rib基因片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of rib gene fragment

圖2 PCR及酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2 Recombinant plasmid verified by PCR and enzyme digestion

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)及SDS－PAGE

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)（圖3）。SDS－PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后目的蛋白能夠大量表達(dá)，但同時(shí)存在兩種形式的蛋白，根據(jù)蛋白大小，推測(cè)分子質(zhì)量較高的（約23ku）為目的基因與膜間隙定位信號(hào)融合蛋白，分子質(zhì)量較低的（約18ku）為膜間隙定位信號(hào)切除后的目的蛋白。

2.4 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化及蛋白形式鑒定

對(duì)誘導(dǎo)后菌體進(jìn)行超聲波破碎，將上清和沉淀分別電泳，結(jié)果顯示在所有條件下，重組表達(dá)蛋白均形成包涵體。在低溫條件下，表達(dá)的蛋白僅為分子質(zhì)量較小的目標(biāo)蛋白。比較不同IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的差異，IPTG濃度為0.05mmol／L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高（圖4）。

2.5 Rib蛋白的純化與濃度測(cè)定

對(duì)包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性，利用親和凝膠對(duì)復(fù)性后Rib重組表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示目的蛋白得到了較好的純化（圖5），蛋白濃度為0.480mg／mL。

圖3 SDS－PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 SDS－PAGE analysis of induced protein

圖4 SDS－PAGE檢測(cè)包涵體Fig.4 SDS－PAGE analysis of inclusion bodies

圖5 純化后以及復(fù)性后SDS－PAGEFig.5 SDS－PAGE analysis of renatured and purified protein

2.6 重組蛋白的質(zhì)譜鑒定

將純化后的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（圖6），結(jié)果顯示該蛋白與無(wú)乳鏈球菌Rib蛋白的相似性達(dá)到99.99%，確定獲得的蛋白為正確的目的蛋白。

2.7 多克隆抗體的制備

利用間接ELISA測(cè)定多克隆抗體效價(jià)，結(jié)果顯示多克隆抗體效價(jià)為1∶480000。

3 討論

本研究選擇了pET26b作為表達(dá)載體，該載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（His－Tag），表達(dá)產(chǎn)物為His融合蛋白，方便后續(xù)的親和凝膠純化。此外，該載體還含有pelB信號(hào)肽序列，位于起始密碼和目的基因之間，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，使蛋白分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間，減少形成包涵體的可能性。本試驗(yàn)在對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行SDS－PAGE時(shí)有2個(gè)蛋白條帶，我們推測(cè)分子質(zhì)量較大的蛋白正是由于融合了pelB而形成的。雖然使用pET26b載體進(jìn)行表達(dá)比較容易獲得可溶性蛋白，但本試驗(yàn)的蛋白仍然形成了包涵體，經(jīng)過(guò)變性復(fù)性才最終獲得可溶蛋白。以上結(jié)果顯示，pET26b表達(dá)載體并不適合可溶性Rib蛋白的表達(dá)。但是這并不妨礙這一蛋白作為疫苗或作為免疫檢測(cè)靶標(biāo)應(yīng)用于后續(xù)研究。

圖6 Rib質(zhì)譜鑒定Fig.6 Rib identification by MS

根據(jù)已有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，對(duì)Rib蛋白的鑒定顯示它與α蛋白具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)及序列，它們都含有N端結(jié)構(gòu)域和重復(fù)序列，經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩種蛋白這兩個(gè)區(qū)域的相似度分別達(dá)到61%和47%。因此通常把它們與另外兩種結(jié)構(gòu)相似的蛋白R(shí)28與Alp2同歸為Alp（α－like protein）蛋白家族，但是這兩種蛋白沒(méi)有交叉免疫性。而且α蛋白主要存在于Ia、Ib以及Ⅱ型菌株中，在Ⅲ型中不存在此蛋白，而Rib蛋白是在Ⅲ型菌株中發(fā)現(xiàn)的，而且大多數(shù)表達(dá)α蛋白的菌株都不表達(dá)Rib蛋白[10]?？梢?jiàn)，僅利用α蛋白作為疫苗雖然能夠?qū)Χ喾N血清型病原菌的感染產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，但是仍然會(huì)遺漏部分菌株。因此，利用Alp蛋白作為疫苗應(yīng)該將多種表面蛋白混合使用。本研究獲得了Rib重組蛋白，為無(wú)乳鏈球菌全面保護(hù)性疫苗的開(kāi)發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

Gravekamp C等[11]通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列會(huì)減弱整個(gè)蛋白的免疫反應(yīng)，而且通過(guò)對(duì)Rib蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 （http：／／smart.embl－h(huán)eidelberg.de）發(fā)現(xiàn)該蛋白N端結(jié)構(gòu)域包含跨膜區(qū)，文獻(xiàn)[12]顯示該區(qū)域不僅與細(xì)菌的防御機(jī)制有關(guān)，而且與細(xì)菌毒性（包括黏附，侵染甚至誘發(fā)感染性休克）密切相關(guān)，根據(jù)這些研究推測(cè)N端結(jié)構(gòu)域在刺激宿主免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮重要作用，是一段理想的候選疫苗與免疫檢測(cè)靶標(biāo)。因此，本研究選擇Rib的N端序列，一方面由于片段較短便于克隆、表達(dá)，另一方面，能夠更好的保證蛋白的免疫原性。

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