史春生 金慧軍 趙君 王升志 毛祖彝

（1.煙臺市福山區(qū)人民醫(yī)院 口腔科，煙臺 265500；2.青島大學醫(yī)學院附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院 口腔頜面外科，煙臺 264000；3.口腔疾病研究國家重點實驗室，四川大學，成都 610041）

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療后的效果與機體的免疫功能狀態(tài)有著非常密切的關(guān)系。在腫瘤治療中，化療最大的問題就是藥物對免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的損傷。熱化療作為一種很有前途的癌癥治療手段[1]，可以降解化療藥物的毒副作用[2]。學者們認為其具有明顯的生物學效應(yīng)[3-4]。熱化療除了直接殺傷腫瘤細胞以及增強局部化療藥效外[3]，還可以刺激免疫系統(tǒng)的功能，增加CD3+T、CD4+T細胞的數(shù)量，提高CD4+/CD8+的比值[5-6]。另外，細胞因子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤治療方面的價值日益受到人們的重視，其中白細胞介素（interleukin，IL）-2和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α在細胞因子抗腫瘤方面的作用有著非常重要的地位[7-8]，但目前關(guān)于熱化療后口腔癌宿主T細胞和細胞因子功能狀態(tài)的變化及其相互關(guān)系尚無系統(tǒng)研究報道。本研究旨在通過對荷瘤鼠及口腔癌患者進行不同處理，觀察熱化療對荷瘤宿主T細胞功能及IL-2和TNF-α水平變化的影響，探討T細胞和細胞因子功能狀態(tài)的變化間有無相關(guān)性，并進一步探討熱化療引起荷瘤宿主免疫功能改變的機理。

1 材料和方法

1.1 試劑和設(shè)備

平陽霉素（天津太河制藥有限公司），IL-2、TNF檢測試劑盒（Sigma公司，美國），501型超級恒溫器（上海實驗儀器廠），915型微波熱療機（成都錦江電機廠），酶聯(lián)免疫檢測儀（DG-3022型，江蘇省華東電子管廠）。

1.2 小鼠腫瘤模型的建立和熱化療處理

選取四川省抗生素研究所提供的8周齡Balb/c純系小白鼠100只，雌雄各半。小白鼠分籠飼養(yǎng)3 d后，隨機平均分為5組，分別為正常對照組（N組）、不治療組（NT組）、平陽霉素治療組（P組）、高溫治療組（H組）、高溫聯(lián)合平陽霉素治療組（HP組），每組20只，雌雄各半。后4組為實驗組，于開始治療前48 h，經(jīng)同一人操作，在每只小鼠右后足底皮下注入S180細胞（0.1mL培養(yǎng)基中2×107個瘤細胞，腹水型，皮下接種后可生成實體型。由四川大學生物治療國家重點實驗室提供）。接種瘤細胞48 h后，給P組和HP組小鼠腹腔注射平陽霉素（0.1mL培養(yǎng)基含0.2mg）；HP組給藥后立即用恒溫水（42.0℃±0.2℃）加溫右后足荷瘤部位，歷時30min。H組接受與HP組相同的加溫處理。7 d后各治療組重復上一次治療。于第2次治療后15 d將動物全部處死，完整剝離腫瘤稱重，在無菌條件下取其脾臟，采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法行淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)（lymphocyte transformation index，LTI）及IL-2、TNF-α水平檢測。

1.3 臨床病例

選取2007年9月—2009年11月就診于四川大學華西口腔醫(yī)院熱療中心的20例口腔癌患者為研究對象。其中男性12人，女性8人。年齡42～70歲，平均56歲。被納入的20例患者均未經(jīng)任何治療，無嚴重并發(fā)癥和重復癌。其中唇癌12例，顏面皮膚癌8例。病理組織學診斷均為鱗狀細胞癌，其中低分化4例，中分化10例，高分化6例。臨床分期為T2～T4。

1.4 患者的熱化療處理

對20例口腔癌患者給予每周2次（周二、五），5周10次一療程的熱化療處理。靜脈注射平陽霉素8mg后，立即給予42.5℃±0.2℃、40min微波熱療。分別于第一次治療前和最后一次治療后采集外周靜脈血，用MTT法[5]測IL-2、TNF-α水平，并采用3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入法行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗及CD4+、CD8+T細胞亞群檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。對動物實驗IL-2、TNF-α水平結(jié)果行組間兩兩比較LSD-t檢驗；對動物實驗LTI的結(jié)果按完全隨機設(shè)計的多樣本均數(shù)間的兩兩比較作q檢驗；對口腔癌患者熱化療前后LTI、T淋巴細胞亞群及IL-2、TNF-α水平行組間配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的抑瘤效果

經(jīng)熱化療后，HP組小鼠的抑瘤率達到83%，H組和P組的抑瘤率分別為50%和57%，HP組抑瘤效果明顯高于H組和P組（P＜0.01）。

2.2 各組小鼠IL-2、TNF-α活性

各組小鼠IL-2、TNF-α活性的MTT檢測結(jié)果見圖1。第2次治療后15 d，HP組和N組、H組和P組、P組和NT組之間的IL-2值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組之間的IL-2值差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TNF-α與之相同。

2.3 各組小鼠的LTI

第2次治療后15 d，各組小鼠LTI的MTT檢測結(jié)果見圖2。由圖2可見，HP組、H組與N組小鼠的LTI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而P組和NT組與HP組、H組、N組的LTI差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4 20例口腔癌患者熱化療前后各檢測值的變化

20例口腔癌患者熱化療前后IL-2、TNF-α的活性以及LTI、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+的變化見圖3。由圖3可見，在熱化療后IL-2和TNF–α明顯升高（P＜0.01）；采用3H-TdR摻入法行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗及CD4+、CD8+T細胞亞群檢測發(fā)現(xiàn)，在熱化療后LTI、CD4+及CD4+/CD8+明顯升高（P＜0.01），而CD8+值無明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

T淋巴細胞在腫瘤的免疫效應(yīng)中起著非常重要的作用，它不僅能直接殺傷腫瘤細胞，而且能產(chǎn)生許多淋巴因子調(diào)節(jié)機體的免疫狀態(tài)[9-11]。T細胞分為CD4+和CD8+兩大亞群，按功能不同分為輔助性T細胞（help T cell，Th）、細胞毒性T細胞（cytotoxic T cell，CTL或Tc）、抑制性T細胞（suppressor T cell，Ts）。CD4+T細胞主要是Th細胞，少數(shù)為CTL，其對抗體生成、巨噬細胞活化及CTL的活化有輔助、放大效應(yīng)，并通過它們發(fā)揮作用。Ts能通過抑制細胞免疫功能來調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答，正常狀態(tài)下保持著一定的數(shù)量及活性水平，當發(fā)生腫瘤后，這類細胞數(shù)量顯著增多，抑制機體對腫瘤的免疫效應(yīng)，從而使腫瘤逃避機體的免疫監(jiān)視，促進腫瘤的生長。

細胞因子在與靶細胞膜上特異性受體結(jié)合后發(fā)揮免疫功能作用。腫瘤可通過各種不同途徑來影響機體的免疫功能，使荷瘤宿主呈現(xiàn)免疫抑制狀態(tài)，其中一種是腫瘤細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），它可以抑制IL-2誘導的T細胞和IL-2受體的表達，抑制T細胞活化，從而抑制IL-2的分泌；而腫瘤細胞分泌的前列腺素（prostaglandin，PG）也能使IL-2受到抑制。腫瘤使巨噬細胞和淋巴細胞受到抑制，從而使TNF-α分泌減少。

近幾年國內(nèi)外多項研究表明，癌癥患者外周血T細胞亞群有著明顯的變化，CD4+細胞（Th）減少，CD8+細胞（Ts和Tc）增多，CD4+/CD8+比值下降或倒置，且這種變化隨著腫瘤的進展愈加明顯[12-15]。其機理是腫瘤通過表達、釋放某種腫瘤抗原或其他可溶性物質(zhì)誘導激活Ts細胞，從而參與機體的免疫抑制[4]。而在本文動物實驗中，NT組和P組由于免疫系統(tǒng)的抑制，淋巴細胞轉(zhuǎn)化指數(shù)及產(chǎn)生的IL-2、TNF活性下降，與N組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；HP組由于受到熱療和化療的作用，LTI及IL-2、TNF-α活性均升高，與NT及P組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而與N組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。臨床實驗中，口腔癌患者IL-2、TNF-α水平以及LTI、CD4+和CD4+/CD8+在熱化療后明顯升高（P＜0.01）。表明熱化療后可使荷瘤機體的免疫抑制狀態(tài)得以解除，機體免疫功能增強，LTI及其產(chǎn)生細胞因子的能力均提高，從而機體對腫瘤細胞的細胞免疫應(yīng)答增強。同時該結(jié)果也提示熱化療組不會因為化療藥物的副作用而降低溫熱對淋巴細胞功能的影響，也不會由于溫熱過度刺激免疫系統(tǒng)，導致免疫功能的紊亂。

IL-2在腫瘤免疫中作為最重要的細胞因子之一，具有以下功能：1）增強T細胞功能[16]，IL-2是T細胞最重要的生長因子，能直接或間接促T細胞的增殖活化，誘導CTL，維持T細胞增殖，增加細胞因子的產(chǎn)生，通過活化CTL或Th發(fā)揮抗癌作用；2）誘導和增強自然殺傷細胞、CTL的活性[17]；3）誘導T細胞分泌細胞因子；4）增強抗體依賴細胞介導的細胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）[18]。本實驗荷瘤鼠以及口腔癌患者熱化療后，IL-2、LTI、CD4+及CD4+/CD8+明顯升高，呈現(xiàn)相同變化趨勢，從而進一步證明了IL-2能直接或間接促進T細胞的增殖活化，而活化的T細胞可以繼續(xù)分泌細胞因子，協(xié)同增強免疫功能，二者之間存在著緊密的聯(lián)系。

綜上所述，熱化療后可使荷瘤宿主者免疫抑制狀態(tài)得以解除，同時能降低化療藥物對機體免疫功能損傷的毒副作用，LTI升高，Th增多，IL-2、TNF-α等細胞因子活性增強，從而使機體免疫功能增強，機體對腫瘤的免疫應(yīng)答加強。

[1]Colombo R,Salonia A,Leib Z,et al.Long-term outcomes of a randomized controlled trial comparing thermochemotherapy with mitomycin-C alone as adjuvant treatment for non-muscle-invasive bladder cancer（NMIBC）[J].BJU Int,2011,107（6）：912-918.

[2]Rowe RW,Strebel FR,Proett JM,et al.Fever-range whole body thermotherapy combined with oxaliplatin：A curative regimen in a pre-clinical breast cancer model[J].Int J Hyperthermia,2010,26（6）：565-576.

[3]Burd R,Dziedzic TS,Xu Y,et al.Tumor cell apoptosis,lymphocyte recruitment and tumor vascular changes are induced by low temperature,long duration（fever-like） whole body hyperthermia[J].J Cell Physiol,1998,177（1）：137-147.

[4]Zhao J,Wang SZ,Tang XF,et al.Analysis of thermochemotherapyinduced apoptosis and the protein expressions of Bcl-2 and Bax in maxillofacial squamous cell carcinomas[J].Med Oncol,2011,28（Suppl 1）：S354-S359.

[5]Storm FK.Hyperthermia in cancer therapy[M].Boston：GK Hall Medical Publishers,1983：487-544.

[6]梁新華,王升志,毛祖彝.熱化療對唇癌患者T淋巴細胞免疫功能的影響[J].四川大學學報：醫(yī)學版,2004,35（2）：220-222.Liang Xinhua,Wang Shengzhi,Mao Zuyi.Effects of thermochemotherapy on immunologic function of patients with lip cancer[J].JSichuan University：Medical Science Edition,2004,35（2）：220-222.

[7]Westwood JA,Darcy PK,Guru PM,et al.Three agonist antibodies in combination with high-dose IL-2 eradicate orthotopic kidney cancer in mice[J].J Transl Med,2010,8：42.

[8]Nakagawa J,Saio M,Tamakawa N,et al.TNF expressed by tumor-associated macrophages,but notmicroglia,can eliminate glioma[J].Int J Oncol,2007,30（4）：803-811.

[9]Wang HY,Lee DA,Peng G,et al.Tumor-specific human CD4+regulatory T cells and their ligands：Implications for immunotherapy[J].Immunity,2004,20（1）：107-118.

[10]Qian F,Gnjatic S,J?ger E,et al.Th1/Th2 CD4+T cell responses against NY-ESO-1 in HLA-DPB1*0401/0402 patients with epithelial ovarian cancer[J].Cancer Immun,2004,4：12.

[11]Janssen EM,Droin NM,Lemmens EE,et al.CD4+T-cell help controls CD8+T-cell memory via TRAIL-mediated activation-induced cell death[J].Nature,2005,434（7029）：88-93.

[12]Waziri A,Killory B,Ogden AT 3rd,et al.Preferential in situ CD4+CD56+T cell activation and expansion within human glioblastoma[J].J Immunol,2008,180（11）：7673-7680.

[13]Wieckowski EU,Visus C,Szajnik M,et al.Tumor-derived microvesicles promote regulatory T cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated CD8+T lymphocytes[J].J Immunol,2009,183（6）：3720-3730.

[14]Brivio F,Fumagalli L,Parolini D,et al.T-helper/T-regulator lymphocyte ratio as a new immunobiological index to quantify the anticancer immune status in cancer patients[J].In Vivo,2008,22（5）：647-650.

[15]Mazur MA,Davis CC,Szabolcs P.Ex vivo expansion and Th1/Tc1 maturation of umbilical cord blood T cells by CD3/CD28 costimulation[J].Biol Blood Marrow Transplant,2008,14（10）：1190-1196.

[16]Salcedo R,Hixon JA,Stauffer JK,et al.Immunologic and therapeutic synergy of IL-27 and IL-2：Enhancement of T cell sensitization,tumor-specific CTL reactivity and complete regression of disseminated neuroblastoma metastases in the liver and bone marrow[J].J Immunol,2009,182（7）：4328-4338.

[17]Li YG,Wang ZP,Tian JQ,et al.Dendritic cell transfected with secondary lymphoid-tissue chemokine and/or interleukin-2 geneenhanced cytotoxicity of T-lymphocyte in human bladder tumor cell S in vitro[J].Cancer Invest,2009,27（9）：909-917.

[18]Hara M,Nakanishi H,Tsujimura K,et al.Interleukin-2 potentiation of cetuximab antitumor activity for epidermal growth factor receptor-overexpressing gastric cancer xenografts through antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Cancer Sci,2008,99（7）：1471-1478.