彭沙沙， 童再康， 黃華宏， 周厚君， 時 劍， 林二培

（浙江農(nóng)林大學 林業(yè)與生物技術學院， 浙江 臨安311300）

纖維素是植物細胞壁的主要成分， 自然界中大約有1 800 億t·a－1的纖維素產(chǎn)物產(chǎn)生， 具有較高的經(jīng)濟價值［1］。 研究表明： 纖維素的生物合成是纖維素合成基因、 非纖維素多糖合成基因以及結構蛋白基因等在細胞發(fā)育調(diào)控下進行協(xié)同表達、 相互作用的過程。 纖維素合成酶作為植物纖維素合成途徑中的關鍵酶影響著纖維的產(chǎn)量和品質， 探明纖維素合成酶的作用機制及其在纖維合成過程中的功能， 對于材性品質改良至關重要。 纖維素合成酶類似蛋白作為一種重要的膜蛋白， 與纖維素合成酶具有相似的蛋白結構， 都含有D， D， D， QXXRW 保守區(qū)， 與棉花Gossypium hirsutum 纖維素合成酶相比， 最明顯的差異在于后者具有額外的特異序列。 在擬南芥Arabidopsis thaliana［2-4］， 水稻Oryza sativa［5-6］， 煙草Nicotiana alata［7］， 美洲山楊Populus tremuloides［8］等多種植物種已發(fā)現(xiàn)， 纖維素合成酶類似蛋白基因有A， B， C，D， E， F， G， H 等8 個龐大的基因家族， 也證實了幾個類纖維合成酶（Csl）直接參與纖維的生物合成，但對其功能的了解不十分清楚。 本研究選用杉木Cunninghamia lanceolata 為材料來研究纖維素合成酶類似蛋白基因， 克隆了1 個CslD 基因， 并對其進行生物信息學分析， 為該基因的功能研究奠定基礎， 同時也為利用CslD 基因對杉木進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

杉木取自浙江農(nóng)林大學遺傳學科苗圃地（29°56′N， 118°51′E）， 取其莖葉作為mRNA 的提取材料。

1.2 試劑

克隆用的大腸埃希菌Escherichia coli 5α 為本研究小組實驗室保存； PureLinkTMPlant RNA Reagen 試劑盒（Invitrogion）； cDNA 合成試劑盒（Clon Tech）； T4 DNA 連接酶和克隆載體pMD-T19 均為TaKaRa 公司生產(chǎn)； AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AxyGEN）； 引物由南京金思特生物工程技術服務有限公司合成；cDNA 末端快速擴增（RACE）試劑盒為Clone-Tech 產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

莖葉mRNA 的提取按照PureLinkTMPlant RNA Reagen 試劑盒說明書進行， 并于10.0 g·kg－1瓊脂葡萄糖凝膠電泳檢測RNA 提取效果（圖1）。

從GenBank 數(shù)據(jù)庫中獲得纖維素合成酶基因的編碼序列， 通過Clustal X2 進行多序列比對， 根據(jù)序列保守性， 設計RT-PCR 引物RR： 5′-TGYTAYGTNCARTTYCCWC-3′和RF： 5′-GANCCRTADATCCANCC-3′（Y： C or T； N： A or T or C or G； R： A or G； W： A or T； D： A or G or T）。 比對的基因編碼序列：火炬松Pinus radiata 登錄號AAQ63936； 顫楊Populus tremuloides 登錄號AAO25536.1； 毛果楊Populus trichocarpa 登錄號XP_002324291； 馬占相思Acacia mangium 登錄號AAT66940.1。 cDNA 的合成及聚合酶鏈式反應（PCR）的擴增均參照試劑盒說明書進行。 凝膠回收PCR 產(chǎn)物， 按照pMD-T19 載體試劑盒操作流程， 將回收的DNA 片段連接到T 載體上， 轉化大腸埃希菌DH5α 菌株， 藍白斑篩選， 陽性克隆送南京金斯特生物工程技術服務有限公司測序。 測序結果經(jīng)BLAST（basic local alignment search tool）檢索序列數(shù)據(jù)庫， 確定所克隆序列為杉木ClCslD1 基因編碼序列。 根據(jù)反轉錄-聚合酶鏈式反應 （RT-PCR）片段的序列測定結果， 合成ClCslD1 特異引物GSP1： 5′-ACACATCCCGTTCCGACATACACAG-3′和GSP2： 5′-CTGGCAGATTCCATTCCCATCGCAG-3′， 分別用于克隆cDNA 的5′和3′端序列。 5′RACE 和3′RACE 具體步驟均按SMATRTMRACE cDNA Amplification Kit （ClonTech）的說明書進行， PCR 產(chǎn)物凝膠回收后經(jīng)T載體克隆測序， 并與已克隆的CslD1 基因編碼區(qū)拼接， 從而獲得全長cDNA 序列。 以拼接得到的ClCSLD1 全長cDNA 設計引物CslD1-U： 5′-GAGACATTTGAATAACAGGCGTG-3′和CslD1-L： 5′-TTGAAGCTAGTCAGATCCAACCA-3-′， 再經(jīng)PCR 擴增， 凝膠電泳分析、 測序， 驗證所獲基因全長的準確性。

用Nucleic Tools 分析推測CslD1 基因編碼蛋白質的氨基酸組成， 用ProtParam（http： //www.expasy.org/tools/protparam.html）推測其分子量和等電點（PI）， 用ProtScale （http： //ca.expasy.org/tools/protscale.html）推測其疏水性， 用TMHMM（http： //www.cds.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 對其跨膜區(qū)進行預測， 并用SignalP （http： //www.cds.dtu.dk/services/SignalP/）軟件對其N 端進行分析， 并進行蛋白質亞細胞定位， 同時用ExPASy 的HNN（http： //www.expasy.org/tools/HNN.html）預測其二級結構進行， 利用蛋白質保守結構域推測工具InterProScan（http： //ebi.ac.uk/Tools./InterProScan/）分析ClCslD1 的結構域。

分析杉木ClCslD1 與其他植物同源蛋白序列的同源性時， 在美國國家生物技術信息中心（NCBI）上用其BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nig.gov/blast）分別將杉木的ClCslD1 蛋白質序列與其他植物的CslD 蛋白質序列進行同源性比對。 同時用ClustalX2 軟件對不同植物的CslD 蛋白質序列與杉木CslD1 蛋白序列進行多重序列比對， 并用MEGA3［9］軟件構建不同植物的CslD 基因進化樹。

2 結果與分析

2.1 杉木CslD1 基因的分離與分析

用PureLinkTMPlant RNA Reagen 試劑盒提取的RNA（圖1）， 電泳后28SrRNA 和18SrRNA 兩條主帶明顯， 且28SrRNA 條帶亮度約為18srRNA 條帶亮度的2 倍。 這說明RNA 基本上沒降解， 且無彌散。 同樣加樣孔附近沒有雜帶， 說明產(chǎn)物中沒有DNA 的存在。

取上述RNA 利用逆轉錄酶獲得cDNAs（圖2）， 通過RT-PCR， 獲得1 個約600 bp 的產(chǎn)物， 連接到T載體且轉化DH5α， 挑取陽性克隆測序。 測序結果用NCBI 的BLAST 程序檢索數(shù)據(jù)庫， 顯示該序列與擬南芥、 煙草、 毛果楊的同源性都達到80%以上， 確定該片段為杉木的ClCslD1 基因片段。 用該序列設計特異引物GSP1 和GSP2， 分別克隆基因cDNA 的5′和3′端序列。 測序結果表明： 5′和3′端序列與獲得的ClCslD1 基因編碼序列有重疊， 為ClCslD1 的5′和3′端序列。 經(jīng)拼接得到杉木的ClCslD1 基因完整的cDNA 序列， 共4 150 bp（圖3）。

測序結果BLAST 顯示： 在核苷酸水平上， 杉木ClCslD1 基因與毛果楊（XM＿002325781）， 顫楊（AY-162184）， 擬南芥（AF232907）， 煙草（AF304375）的相似性高達73%， 73%， 72%和70%。 其氨基酸序列的同源性與水稻（DAA01756）， 顫楊（AAO03579）， 擬南芥（NP＿186955）， 煙草（AF304375_1）的同源性高達71%， 81%， 78%和74%， 表明所克隆基因確實為杉木的纖維素合成酶類似蛋白D 基因（圖4）。

圖1 杉木總RNA 提取結果Figure 1 Total RNA preparation Cunninghamia lanceolata

圖2 杉木RNA 反轉錄產(chǎn)物Figure 2 RT product of Cunninghamia lanceolata RNA

圖3 杉木CslD1 全長cDNA RTPCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜Figure 3 Agrose gel electropheropram of RTPCR product of CslD1 full-length cDNA in Cunninghamia lanceolata

2.2 杉木CslD1 基因的生物學信息

ClCslD1 蛋白的結構特點和理化性質。 該蛋白相對分子質量為126 801.2 KD， 等電點為6.68， 理論推導半衰期大于30 h， 不穩(wěn)定系數(shù)為39.64， 屬于穩(wěn)定蛋白； ClCslD1 蛋白的二級結構中α-螺旋（helix）占34.84%， β-折疊（sheet）占14.68%， 無規(guī)則卷曲（coil）占50.94%； 疏水性/親水性分析結果表明， 疏水性最大值為3.067， 最小值為-3.222， 總體屬于親水性蛋白； 跨膜結構預測表明， 該蛋白擁有8 個跨膜區(qū)， 分別是281～303， 310～332， 908～930， 943～962， 977～999， 1 029～1 051， 1 066～1 083 和1 096～1 115，跨膜螺旋長度最小19 個氨基酸殘基， 最大22 個氨基酸殘基， 平均長度為21.25 個氨基酸殘基。 在保守區(qū)A 中含有保守的天冬氨酸殘基， 排列為Dx…xDCD； 在保守區(qū)B 中含有保守的天冬氨酸殘基， 排列為Dx…QVLRW。 蛋白質亞細胞定位預測認定其為細胞質蛋白質（reliability index=2； expected accuracy=74%），而且SignalP 軟件分析該蛋白為非分泌蛋白， 不具有信號肽結構。 此外， 保守功能結構域分析結果顯示，該蛋白質具有一個cellulose＿synt 功能域， 該結構域為纖維素合成酶蛋白家族的一個特征性結構域， 具有催化尿苷二磷酸形成的功能。

圖4 杉木ClCslD1 部分蛋白序列及其他植物同源蛋白序列的比較Figure 4 Comparison of ClCslD1 in in Cunninghamia lanceolata and its homologus protein from other plants

用MEGA3 軟件的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構建不同植物CslD 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。 從構建的發(fā)育樹中可以看出： 杉木CslD1 蛋白與OsCslD2， AtCslD2， AtCslD3 和PtrCslD4 距離最近。 已有研究表明： AtCslD3 在擬南芥根毛的伸長區(qū)及根毛區(qū)細胞壁的抗張強度有關， 而AtCslD2 和OsCslD1 也在根毛區(qū)的表達豐度較強， 推測ClCslD1 可能與根毛區(qū)細胞壁的合成有關， 其具體功能需要進一步驗證。

3 討論

圖5 植物CslD 蛋白的系統(tǒng)進化關系分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of CslD from various plants specious

近年來， 對纖維素合成酶類似蛋白基因的研究獲得了初步成果。 利用擬南芥突變體發(fā)現(xiàn)AtCslAT 基因在擬南芥花粉管及胚胎發(fā)育中起重要作用， 推測此蛋白質對于細胞壁合成是必需的［2］。 用T-DNA 插入法證明： AtCslD3 與擬南芥根毛的伸長及根毛區(qū)細胞壁的抗張強度有關， 推測此蛋白質可能與根毛區(qū)細胞壁合成有關［4］， 而AtCslD2 也在根毛區(qū)表達豐度較高。 Doblin 等［8］研究發(fā)現(xiàn)： 煙草NaCslD1 基因可能是編碼花粉管纖維素合成的特異基因。 Anita 等［7］利用定量PCR 技術發(fā)現(xiàn)PtrCslD2 基因在楊樹木質部細胞的次生壁中有較高豐度的表達， 參與纖維素的合成。 Butron 等［10］將僅在水稻和大麥以及其他谷類中表達的CslD 基因插入到擬南芥中， 結果發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥所產(chǎn)生的β 葡聚糖量很低， 意味著CslF 基因與纖維合成有關， 同時也表明這種細胞壁成分還需要其他的 “補充因子”。 植物纖維素的合成是一個復雜的過程， 而纖維素合成酶和纖維素合成酶類似蛋白基因更是一個大的基因家族。 本研究的局限性在于僅以莖葉組織為材料， 很難克隆出家族中的所有成員。 系統(tǒng)研究其分子調(diào)控過程， 需要克隆更多的纖維素合成酶及類似蛋白基因。 ClCslD1 基因的發(fā)現(xiàn)為進一步在分子水平上研究杉木的纖化打下了基礎。

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