郭 青,周小凡

(南京林業(yè)大學(xué)輕工科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210037)

α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)在動(dòng)物、植物及微生物中均有分布，可隨機(jī)作用于淀粉、糖原、多聚糖或寡糖分子的α-1,4葡萄糖苷鍵，將其降解為葡萄糖、麥芽糖和低聚糖等，是應(yīng)用最早、最廣泛的工業(yè)酶制劑之一，其應(yīng)用涉及食品工業(yè)、釀造發(fā)酵工業(yè)、紡織品工業(yè)、造紙工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[1～6]。α-淀粉酶雖可從動(dòng)物、植物中提取，但其大規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)仍然采用微生物發(fā)酵法。乙基纖維素(Ethyl cellulose，EC)因其優(yōu)良的抗水性、成膜性和化學(xué)惰性，廣泛用于藥物骨架、包衣材料、包囊輔材、載體材料、片劑粘合劑[7～9]等藥物制劑的制備。作者在此采用物理包埋技術(shù)，以PVA海綿作為載體，在其充分吸收α-淀粉酶后，反復(fù)浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在載體表面及內(nèi)部形成一層薄膜，從而完成對(duì)α-淀粉酶的固定化。并研究了固定化α-淀粉酶的特性。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

PVA海綿，寧波智德清潔用品有限公司。裁剪成3 mm×3 mm×3 mm的小顆粒，備用。

α-淀粉酶，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙基纖維素(M70)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)。

HH-S型恒溫水浴鍋，上海葉拓儀器儀表有限公司；7230G型分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)顯pH計(jì)，上海康儀儀器有限公司；電子天平(Max=120 g,d=0.1 mg)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；JJ-791型磁力攪拌器，江蘇金壇宏凱儀器廠。

1.2 固定化方法

取1 gα-淀粉酶放入100 mL去離子水中于40 ℃恒溫活化30 min，過(guò)濾，去除雜質(zhì)；EC用乙酸乙酯配制成0.50%的溶液。

將1 mL活化的α-淀粉酶與50 mg PVA海綿放入燒杯中，反復(fù)擠壓混勻2 min，使PVA海綿充分吸收酶液；再將PVA海綿擠干，經(jīng)流動(dòng)空氣干燥至含水量約80%；將吸收了酶液的PVA海綿轉(zhuǎn)移入燒杯，加入2 mL 0.50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)EC溶液，反復(fù)擠壓3 min左右，使PVA海綿與EC溶液充分混合，然后放入4 ℃冰箱中干燥；再浸泡吸收EC溶液，進(jìn)行二次固定化和干燥，即得固定化α-淀粉酶。

1.3 酶活測(cè)定

α-淀粉酶的活力采用碘-淀粉比色法測(cè)定[10]。

α-淀粉酶活力單位定義:40 ℃下，100 mL酶濾液(1 g酶粉)中的酶與底物淀粉作用30 min，水解10 mg淀粉為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化工藝條件的優(yōu)化

2.1.1 干燥方式對(duì)固定化α-淀粉酶的影響

固定化α-淀粉酶的固定化干燥過(guò)程實(shí)質(zhì)上是乙酸乙酯溶劑蒸發(fā)的過(guò)程，也是EC從液相轉(zhuǎn)化為固相的成膜過(guò)程。隨著乙酸乙酯溶劑的蒸發(fā)，EC體系粘度逐漸增大，直至最后成為固體。

保持其它固定化條件不變，將α-淀粉酶分別在室溫25 ℃和冰箱4 ℃條件下干燥，考察不同干燥方式對(duì)固定化α-淀粉酶重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 干燥方式對(duì)固定化α-淀粉酶的重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響

由圖1可看出，在室溫25 ℃干燥時(shí)，固定化α-淀粉酶的重復(fù)操作穩(wěn)定性較差，相對(duì)酶活較低，并隨著重復(fù)操作次數(shù)的增加而持續(xù)下降；在冰箱4 ℃干燥時(shí)，首次相對(duì)酶活很高，達(dá)到130%左右，自第2次開(kāi)始有所下降，但基本維持在較穩(wěn)定的水平。與室溫25 ℃干燥方式相比，4 ℃干燥的固定化α-淀粉酶在重復(fù)操作穩(wěn)定性方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)多次重復(fù)使用后仍有活力。這是由于，乙酸乙酯在4 ℃時(shí)的蒸發(fā)速度較25 ℃時(shí)的蒸發(fā)速度慢，使得4 ℃下成膜的EC具有更小、更致密的膜孔，在PVA海綿內(nèi)部及表面的α-淀粉酶不易泄漏，從而表現(xiàn)出更好的重復(fù)操作穩(wěn)定性。因此，選擇冰箱4 ℃的干燥方式。

2.1.2 EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化α-淀粉酶的影響

保持其它固定化條件不變，將EC用乙酸乙酯配制成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)：0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%，考察EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化α-淀粉酶重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化α-淀粉酶重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響

由圖2可看出，EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低(0.50%)時(shí)，固定化α-淀粉酶的相對(duì)酶活較高，重復(fù)操作性較好；隨著EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，相對(duì)酶活逐漸下降；當(dāng)EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)0.75%后，固定化α-淀粉酶的重復(fù)操作穩(wěn)定性較好，但相對(duì)酶活普遍較低。這可能與PVA海綿內(nèi)部孔道是否暢通有關(guān)，當(dāng)EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，PVA海綿孔道中因過(guò)多的EC而造成堵塞。由圖2還可看出，固定化α-淀粉酶經(jīng)過(guò)第1次反應(yīng)后，第2次的相對(duì)酶活大幅下降，這可能是由于，第1次反應(yīng)時(shí)生成的產(chǎn)物及反應(yīng)底物將PVA海綿內(nèi)部孔道進(jìn)一步堵塞，從而導(dǎo)致2次操作后的相對(duì)酶活下降。綜合考慮α-固定化酶活力和重復(fù)操作穩(wěn)定性，選擇EC質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.50%。

2.1.3α-淀粉酶濃度對(duì)固定化α-淀粉酶的影響

保持其它固定化條件不變，將α-淀粉酶酶液配成一系列不同濃度(g·L-1)：1、2、3、4、5、6、7，考察α-淀粉酶濃度對(duì)固定化α-淀粉酶重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 α-淀粉酶濃度對(duì)固定化α-淀粉酶重復(fù)操作穩(wěn)定性的影響

由圖3可看出，在第1次操作時(shí)，隨著α-淀粉酶濃度的增大，固定化酶活力有所提高，但是酶液濃度超過(guò)2 g·L-1后，固定化酶活力隨著酶液濃度的增大反而略有下降。這可能與PVA海綿載體的酶負(fù)載量有關(guān)。當(dāng)PVA海綿的酶負(fù)載量達(dá)到飽和時(shí)，固定化酶表現(xiàn)出最大活力。由圖3還可看出，酶液濃度較高時(shí)，均表現(xiàn)出較好的重復(fù)操作穩(wěn)定性。綜合考慮固定化α-淀粉酶活力和重復(fù)操作穩(wěn)定性，選擇α-淀粉酶濃度為4 g·L-1。

2.2 固定化α-淀粉酶的性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)pH值

40 ℃下，選取不同pH值的淀粉溶液分別與游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶反應(yīng)，考察游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH值

當(dāng)酶被固定在某一介質(zhì)內(nèi)部或載體表面時(shí)，由于載體的特性不同，pH值對(duì)酶活力的影響也不一樣[11]。由圖4可看出，游離α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH值為6.0，而固定化α-淀粉酶的最適反應(yīng)pH值為7.0，α-淀粉酶經(jīng)固定化后，最適反應(yīng)pH值往堿性方向移動(dòng)了1個(gè)單位。因此，后續(xù)固定化α-淀粉酶性質(zhì)檢測(cè)均在pH值7.0的條件下進(jìn)行。

2.2.2 最適反應(yīng)溫度

在pH值為6.0的條件下，考察游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶在30～70 ℃的酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)溫度

由圖5可看出，游離α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，固定化α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃。相對(duì)游離α-淀粉酶，固定化α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度升高了近10 ℃，且在各溫度點(diǎn)都表現(xiàn)出更高的酶活力?？梢?jiàn)，α-淀粉酶經(jīng)固定化后，最適反應(yīng)溫度有所提高，在60 ℃時(shí)活力達(dá)到最高。

2.2.3 熱穩(wěn)定性

分別將固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶放在70 ℃烘箱中保溫，每隔20 min取出部分樣品，冷卻至室溫25 ℃，測(cè)定酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 70 ℃下游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性

由圖6可看出，隨著保溫時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶的酶活力都逐漸下降；保溫140 min后，游離α-淀粉酶已近完全失活，而固定化α-淀粉酶仍保持初始酶活的40%左右?？梢?jiàn)，α-淀粉酶經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性得到了提高。這可能與固定化方法有關(guān)，相比共價(jià)固定或物理吸附固定，經(jīng)包埋固定的酶的熱穩(wěn)定性大多會(huì)得到提高[12]。

2.2.4 重復(fù)使用性

固定化酶的重復(fù)使用性是衡量固定化酶性質(zhì)的重要指標(biāo)之一。在pH值7.0、25 ℃下，用紗網(wǎng)過(guò)濾取出固定化α-淀粉酶，用蒸餾水沖洗3次，以去除表面的底物和產(chǎn)物溶液，然后重復(fù)使用，測(cè)其酶活。連續(xù)重復(fù)使用10次的結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 固定化α-淀粉酶的重復(fù)使用性

由圖7可看出，第1次使用時(shí)酶活力很高；第2次使用時(shí)酶活力大幅下降，但仍保持在一個(gè)較高的水平；從第7次使用開(kāi)始酶活力又進(jìn)一步逐漸下降。這可能是由于，酶部分泄漏或者傳質(zhì)通道被底物或產(chǎn)物堵塞，減少了酶與底物接觸的機(jī)會(huì)，增大了擴(kuò)散限制對(duì)固定化α-淀粉酶活力的影響，從而導(dǎo)致固定化α-淀粉酶的活力下降。這表明，以PVA海綿為載體，再以EC包裹載體包埋制得的固定化α-淀粉酶具有一定的重復(fù)使用性。

2.2.5 儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將游離α-淀粉酶和固定化α-淀粉酶儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，每隔4 d檢測(cè)一次酶活力，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 游離酶和固定化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

由圖8可看出，固定化α-淀粉酶和游離α-淀粉酶的活力均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，儲(chǔ)存32 d后，固定化α-淀粉酶仍能保持初始酶活的60%左右，而游離α-淀粉酶只保留初始酶活的4%左右。可見(jiàn)，α-淀粉酶經(jīng)固定化后儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯著提高。

3 結(jié)論

以PVA海綿作為載體，充分吸收α-淀粉酶后，反復(fù)浸泡吸收EC溶液，待EC干燥后即在載體表面及內(nèi)部形成一層薄膜，從而完成對(duì)α-淀粉酶的固定化。該方法操作簡(jiǎn)便，減少了酶變性的可能，最大程度保留了酶活力。此法制得的固定化α-淀粉酶具有良好的熱穩(wěn)定性、重復(fù)使用性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性，其最適反應(yīng)pH值為7.0、最適反應(yīng)溫度為60 ℃。該方法理論上適用于所有酶的固定化，并且可以使用其它成膜材料代替EC，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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