魏文棟，張 亮*，張 偉

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460；2.重慶隆生農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，重慶 401120）

2009年至今，中央每年安排至少6.25億元項(xiàng)目資金，對(duì)26個(gè)?。▍^(qū)、市）及大連、青島、黑龍江農(nóng)墾和廣東農(nóng)墾的400個(gè)生豬人工授精普及率30%以上、技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)比較健全、能繁母豬存欄2萬頭以上的縣（區(qū)、農(nóng)場(chǎng)），補(bǔ)貼1650萬頭能繁母豬，支持開展豬人工授精工作。各地紛紛建立豬人工授精站，使得優(yōu)秀公豬的基因能夠被迅速地推廣，同時(shí)也使得豬人工授精技術(shù)的發(fā)展取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。但是由于許多豬場(chǎng)對(duì)豬精子密度的測(cè)定多采取目測(cè)估計(jì)的方法，生產(chǎn)出來的精液產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，嚴(yán)重地影響了母豬的繁殖效率[1]。

所以我們就目前使用較多的進(jìn)口的精液密度儀minitube SDM1[2]（圖1）、國產(chǎn)的721分光光度計(jì)（圖2）以及血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（圖3）手工計(jì)數(shù)法測(cè)定精液密度的結(jié)果進(jìn)行比較，希望對(duì)廣大從事豬鮮精生產(chǎn)的工作者的實(shí)際工作能有所幫助。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2012年7月12～30日在重慶市畜牧科學(xué)院養(yǎng)豬研究所育種豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期間公豬舍溫度為25 ℃左右。試驗(yàn)中分別用3種方法對(duì)8頭公豬的18份精液樣品進(jìn)行密度測(cè)定。

圖1 minitube SDM1

圖2 分光光度計(jì)

1.1 精液采集

采用手握法進(jìn)行采精，使用保溫杯收集精液。采集精液時(shí)用3～4層過濾紙濾除精液中的膠質(zhì)等雜質(zhì)，過濾的精液保存在集精杯中。

1.2 精液密度測(cè)定

采精后用minitube SDM1、分光光度計(jì)[3]以及手工計(jì)數(shù)法3種方法測(cè)定公豬精液密度，每種方法測(cè)定3次，并記錄其密度值。

圖3 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)在excell 2010中進(jìn)行準(zhǔn)確性和精確性比較，然后在SPSS 17.0中進(jìn)行配對(duì)樣本T檢驗(yàn)，比較不同儀器測(cè)定結(jié)果與方法的相關(guān)性和差異。

2 結(jié)果與分析

從圖4可見Minitube SDM1和分光光度計(jì)測(cè)定精液的結(jié)果與手工計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果相比都偏大，且分光光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果較大。

2.1 不同測(cè)定儀器的準(zhǔn)確性和精確性比較

圖4 3種方法測(cè)定的精液密度分析

表1 不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性

表2 配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)不同儀器3次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差求平均值即對(duì)2種儀器的精確性作出判斷。Minitube SDM1與分光光度計(jì)測(cè)定精子密度的標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.115和0.266，所以用Minitube SDM1測(cè)定精子密度的精確性高于分光光度計(jì)。

在精液密度檢測(cè)的方法中手工計(jì)數(shù)法被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，所以我們?cè)诒敬卧囼?yàn)中將手工計(jì)數(shù)法得到的結(jié)果看作真實(shí)值。將這2種儀器的測(cè)定結(jié)果與真實(shí)值之差求絕對(duì)值后，再求平均值，即可估計(jì)出該方法與真實(shí)值的接近程度。Minitube SDM1 與 分光光度計(jì) 的|x-μ|均值分別為0.73（億/mL）和1.32（億/mL），所以用Minitube SDM1測(cè)定精子密度的準(zhǔn)確性高于分光光度計(jì)。

2.2 配對(duì)樣本的相關(guān)性

從表1表明2種檢測(cè)方法與手工計(jì)數(shù)的檢測(cè)結(jié)果都有極顯著的相關(guān)性（P<0.01），而其中分光光度法與手工計(jì)數(shù)法測(cè)出的結(jié)果有更高的相關(guān)性。

2.3 配對(duì)T檢驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，用Minitube SDM1和分光光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果分別與手工計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行配對(duì)T檢驗(yàn)，其T值分別為2.51和5.562，且mintibe SDM1的P值均小于0.05卻大于0.01，而分光光度計(jì)的P值小于0.01。故mintibe SDM1測(cè)定結(jié)果與手工計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果存在顯著差異，而和分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果與手工計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果存在極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)所用的2種儀器測(cè)定精子密度的原理都是利用精液光度值與空白液體光度值的比值來估計(jì)樣品中的精子密度[4]，故精液中雜質(zhì)的存在同樣會(huì)使精液對(duì)光的通透性降低從而使得精子密度被過高地估計(jì)，這與我們得到的這2種儀器測(cè)定豬精子密度偏高的試驗(yàn)結(jié)果相符。另外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品中精子密度超過800萬/mL或小于100萬/mL時(shí)，Minitube SDM1會(huì)報(bào)36和35錯(cuò)誤，也就是說Minitube SDM1測(cè)定的范圍為100萬～800萬/mL，所以在精液太濃或太稀的情況下不適合使用Minitube SDM1來測(cè)定精子密度。

雖然Minitube SDM1和分光光度計(jì)測(cè)定精子密度的原理相同，但前者的精確性和準(zhǔn)確性都高于分光光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果。這可能由于分光光度計(jì)測(cè)量精子密度是根據(jù)光度值和精子密度的對(duì)應(yīng)關(guān)系來估計(jì)精子密度，精子樣本容量以及精液取樣的誤差都對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生直接的影響。配對(duì)T檢驗(yàn)的結(jié)果表明這兩種儀器與手工計(jì)數(shù)法的測(cè)定結(jié)果均存在顯著差異，那么這2種儀器的測(cè)定結(jié)果最好作為精子密度測(cè)定的參考值。

而在豬人工授精的實(shí)踐中，在大型的人工授精站中每天有大量精液樣品需要測(cè)定的情況下，可以發(fā)揮Mnitube SDM1操作簡(jiǎn)單、測(cè)定迅速的優(yōu)點(diǎn)，在稀釋過程中適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)，使得精子數(shù)量達(dá)到輸精要求。然而Mnitube SDM1的耗材價(jià)格較高且不可重復(fù)使用，這是制約該儀器無法廣泛應(yīng)用的主要因素。而對(duì)于規(guī)模較小的人工授精站或場(chǎng)內(nèi)人工授精站，在檢測(cè)樣品數(shù)量較少的情況下，可以使用手工計(jì)數(shù)法，能夠得到更準(zhǔn)確的測(cè)定結(jié)果。

[1] 王佳輝，高圣明，唐玲玲，等.應(yīng)用種公豬精子密度圖片估算精子數(shù)方法的研究[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2010(5):211-212.

[2] Mario Baracaldo， Jim Ward，溫鵬，等.稀釋公豬精液的品質(zhì)控制[J].今日養(yǎng)豬業(yè)， 2009(3):31-34.

[3] 張亮，郭宗義，潘紅梅，等.分光光度法快速測(cè)算公豬精子密度的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，5（39）：103-105.

[4] 張濤，張龍珍，莊平，等.分光光度法測(cè)定俄羅斯鱘精子密度標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].海洋漁業(yè)，2009，31(1):87-91.