王方，王燦（1.解放軍第153中心醫(yī)院藥劑科，鄭州45004；.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450008）

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷A.dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根。其性溫，味辛，具有解表散寒、祛風(fēng)止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶等功效，常用于治療感冒頭痛、瘡瘍腫痛等病證[1]。除外用可有效治療黃褐斑[2]、白癜風(fēng)[3]、痊瘡[4]等多種皮膚病外，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)白芷可抑制黑色素生成，具有美白的功效[5]，自先秦以來白芷一直作為祛斑美白藥廣泛使用[6]。對(duì)于白芷延緩皮膚衰老和美白的作用機(jī)制，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其能通竅行表、祛風(fēng)散濕、通利血脈，故能長肌膚，潤顏色[7]，現(xiàn)多從抑制酪氨酸酶活性等方面進(jìn)行研究[8]。前期研究表明，白芷具有較明顯的體內(nèi)、外抗氧化活性。而過氧化損傷的元兇——自由基是導(dǎo)致皮膚衰老和疾病的重要因素之一[9]。這提示，抗氧化活性可能是中藥白芷延緩衰老和美白的作用機(jī)制。本文采用體內(nèi)、外研究相結(jié)合的方法，從抗氧化活性方面對(duì)中藥白芷抗皮膚衰老作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS210S型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司）；UV1000型紫外-可見分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；RT-MR2100型勻漿機(jī)（瑞士KinematicaAg公司）。

1.2 試藥

白芷藥材購自河南省藥材公司，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為真品。維生素C（湖北華中藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20091181）；七寶美髯丸（佛山德眾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：09002）；D-半乳糖（上海恒信化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100926）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·，美國Sigma公司）；超氧陰離子自由由基（O2－）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Hyp）、脂褐素（LF）、羥自由基（·OH）試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，♀♂兼半，體重（20±2）g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物使用合格證號(hào)：804186）。

2 方法

2.1 白芷醇提物的制備

白芷粉碎，過50目篩，加10倍量75%乙醇回流2次，每次1.5 h。混合提取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，計(jì)算收率后，制備成1 000 mg·mL－1生藥濃度的母液，貯藏，備用。

2.2 DPPH·清除能力的測(cè)定[10]

試驗(yàn)以維生素C作陽性對(duì)照。精密稱取20 mg DPPH·，用無水乙醇溶解并定容于250 mL量瓶中，DPPH·溶液濃度即為20 mmol·L－1，4℃避光保存。加樣于具塞試管中，充分混勻，室溫避光靜置30 min，于517 nm波長處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算DPPH·的清除率（P）：P＝[1－（Ai－Aj）/Ac]×100%（式中，Ac為DPPH·溶液與溶劑混合液的吸光度，Ai為DPPH·溶液與供試品溶液的吸光度，Aj為供試品溶液與溶劑混合液的吸光度）。試驗(yàn)重復(fù)3次，求平均值，計(jì)算半數(shù)有效量（ED50）。DPPH·加樣量見表1。

表1 DPPH·加樣量Tab 1 Added amount of DPPH·

2.3 O2-清除能力的測(cè)定

采用超氧陰離子自由基測(cè)試盒，模擬人體黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生O2-。反應(yīng)如下：

按照測(cè)試盒說明進(jìn)行加樣，充分混勻，于37℃恒溫水浴40 min，加入2 mL顯色劑，混勻，靜置10 min，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定550 nm波長處的吸光度A550。待測(cè)液對(duì)O2-的抑制率＝（對(duì)照管A550－測(cè)定管A550）/對(duì)照管A550×100%。

2.4 OH·清除能力的測(cè)定

采用OH·試劑盒，以Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生OH·，反應(yīng)如下：

按照測(cè)試盒說明進(jìn)行加樣，混勻后于37℃反應(yīng)1.0 min。分別加入2 mL顯色劑，室溫放置20 min，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定550 nm波長處的吸光度A550。待測(cè)液對(duì)OH·的抑制率＝（對(duì)照管A550－測(cè)定管A550）/對(duì)照管A550×100%。

2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組與給藥

小鼠60只，♀♂兼半，隨機(jī)分成6組，即空白對(duì)照、模型、七寶美髯丸（3.0 mg·10 g－1）和白芷醇提物高、中、低劑量（6.0、3.0、1.5 mg（生藥）/10 g）組?？瞻讓?duì)照組每只小鼠按0.1 mg·10 g－1ip 1%D-半乳糖水溶液，1 h后各給藥組小鼠按0.2 mg·10 g－1ig給藥，空白對(duì)照和模型組用生理鹽水代替，連續(xù)42 d。末次給藥2 h后處死小鼠，取標(biāo)本進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

2.6 皮膚勻漿的制備

取脫毛皮膚組織0.6 g，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其它結(jié)締組織，濾紙拭干，稱重，取該組織塊9倍重量生理鹽水制成10%組織勻漿。

2.7 皮膚勻漿指標(biāo)的測(cè)定

皮膚勻漿中SOD活性和Hyp、MDA、LF含量均根據(jù)測(cè)試盒所附方法、步驟進(jìn)行測(cè)定；皮膚含水量的測(cè)定采用烘干法：1.0 g脫毛皮膚，精密稱取濕重后80℃烘干12 h，稱其干重，計(jì)算皮膚含水量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0 for Windows軟件包，計(jì)量資料，組間比較采用單因素方差分析，各數(shù)據(jù)用±s表示，以P＜0.05表示差異有顯著性。對(duì)多指標(biāo)間進(jìn)行多元相關(guān)分析。

3 結(jié)果

3.1 白芷醇提物對(duì)DPPH·、O2-、OH·3種自由基的清除作用

對(duì)DPPH·、O2-、OH·3種自由基的清除作用，白芷醇提物的ED50分別為1.96、89.14、114.05 mg·mL－1，維生素C的ED50分別為0.14、50.06、121.60 mg·mL－1，前者分別是后者的0.07、0.56、1.07倍，表明白芷醇提物對(duì)DPPH·、O2-的清除作用比維生素C弱，但對(duì)OH·自由基清除作用與維生素C相當(dāng)。白芷醇提物、維生素C對(duì)3種自由基的清除作用分別見圖1～圖3。

圖1 白芷醇提物、維生素C對(duì)DPPH·的清除作用Fig 1 Scavenging effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on DPPH·

圖2 白芷醇提物、維生素C對(duì)O2-的清除作用Fig 2 Scavenging effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on O2-free radical

3.2 白芷醇提物對(duì)衰老模型小鼠皮膚組織勻漿中SOD、MDA、LF的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚勻漿中SOD活性顯著減弱，MDA、LF含量均顯著升高（P＜0.01），說明復(fù)制模型成功。與模型組比較，白芷醇提物高、中、低劑量組小鼠皮膚勻漿中SOD活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量均顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）；白芷提取液高、中劑量組小鼠皮膚勻漿中LF水平顯著降低（P＜0.01）；白芷醇提物低劑量組LF水平降低效果不顯著（P＞0.05）。結(jié)果提示，白芷醇提物能提高衰老小鼠皮膚組織的抗氧化能力和清除過氧化產(chǎn)物的能力，且在一定范圍內(nèi)有量效關(guān)系。白芷醇提物對(duì)衰老模型小鼠皮膚中的SOD、MDA、LF的影響見表2。

圖3 白芷醇提物、維生素C對(duì)OH·的清除作用Fig 3 Scavenging effects of ethonol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on OH·

表2 白芷醇提物對(duì)衰老模型小鼠皮膚中SOD、MDA、LF的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix on SOD，MDA and LF in the skin of aging model mice（±s，n＝10）

表2 白芷醇提物對(duì)衰老模型小鼠皮膚中SOD、MDA、LF的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix on SOD，MDA and LF in the skin of aging model mice（±s，n＝10）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型組白芷醇提物高劑量組白芷醇提物中劑量組白芷醇提物低劑量組七寶美髯丸組LF/μg·g－1 0.69±0.20 1.17±0.11＊0.79±0.09##0.83±0.16##1.16±0.10 1.08±0.13#劑量/mg·10 g－1--6.0 3.0 1.5 3.0 SOD/U·mg－1 25.14±3.15 13.44±3.11＊22.06±2.19##21.91±3.45##18.86±3.53#23.69±2.64##MDA/nmol·mg－1 6.14±1.98 12.26±2.07＊7.96±1.28##8.02±1.53##9.89±1.49#8.20±1.74##

3.3 白芷醇提物對(duì)模型小鼠皮膚中Hyp、皮膚含水量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚勻漿中Hyp、皮膚含水量均顯著減少（P＜0.01或P＜0.05），說明復(fù)制模型成功。與模型組比較，白芷醇提物高、中劑量組小鼠皮膚勻漿中Hyp、皮膚含水量均顯著提高（P＜0.01或P＜0.05）；白芷醇提物低劑量組小鼠皮膚勻漿含水量顯著提高（P＜0.05），對(duì)提高皮膚Hyp含量效果不顯著（P＞0.05）。結(jié)果提示，白芷醇提物有一定美白、抗衰老作用，并呈現(xiàn)一定劑量依賴關(guān)系。白芷醇提物對(duì)模型小鼠皮膚中Hyp和皮膚含水量的影響見表3。

3.4 白芷醇提物高劑量對(duì)模型小鼠皮膚中Hyp的影響與對(duì)SOD、MDA、LF等影響的多元相關(guān)分析

本研究中白芷醇提物高劑量組對(duì)衰老模型小鼠皮膚中的衰老指標(biāo)Hyp和氧化或抗氧化相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA、LF等均有較顯著影響，本文以皮膚Hyp為應(yīng)變量，以SOD、MDA、LF等為自變量進(jìn)行多元相關(guān)分析，以探討白芷延緩皮膚衰老可能的作用機(jī)制。

多重線性回歸各變量建立回歸方程：Y＝－17.055+0.888X1+0.434X2+2.739X3。變量系數(shù)通過標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化以后，發(fā)現(xiàn)3個(gè)自變量對(duì)Hyp影響的大小次序依次是SOD＞MDA＞LF。多元相關(guān)分析表明，Hyp與SOD、MDA、LF組合之間的復(fù)相關(guān)系數(shù)r＝0.921，決定系數(shù)R2＝0.848，說明他們之間相關(guān)性較好。結(jié)果表明，白芷醇提物抗氧化能力與抗皮膚衰老活性間有密切關(guān)系。白芷醇提物高劑量組SOD、MDA、LF與Hyp的指標(biāo)變化見表4；回歸分析系數(shù)見表5；回歸模型見表6。

表3 白芷醇提物對(duì)模型小鼠皮膚中Hyp和皮膚含水量的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of ethomol extract from Angelicae Dahuricae Radix on Hyp and moisture in model mice skin（±s，n＝10）

表3 白芷醇提物對(duì)模型小鼠皮膚中Hyp和皮膚含水量的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of ethomol extract from Angelicae Dahuricae Radix on Hyp and moisture in model mice skin（±s，n＝10）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白對(duì)照組模型組白芷高劑量組白芷中劑量組白芷低劑量組七寶美髯丸組水分/%59.94±3.61 49.62±2.81＊60.19±3.46##58.31±2.24##55.97±3.91#59.22±3.13##劑量/mg·10 g－1--6.0 3.0 1.5 3.0 Hyp/μg·mg－1 9.06±1.46 4.96±1.62＊＊8.15±1.32##6.48±1.74#5.71±1.56 8.08±1.65##

表4 白芷醇提物高劑量組SOD、MDA、LF與Hyp的指標(biāo)變化Tab 4 Changes of SOD，MDA，LF and Hyp in ethanol extract fromAngelicae Dahuricae Radix high-dose group

表5 回歸分析系數(shù)Tab 5 Regression analysis coefficient

表6 回歸模型Tab 6 Regression model

4 討論

SOD廣泛存在于各種生物體內(nèi)，皮膚中的SOD可有效阻止自由基對(duì)皮膚組織細(xì)胞的攻擊，有除皺、除斑、美白的功效，其含量高低可以表明皮膚抗氧化能力的強(qiáng)弱；MDA是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的細(xì)胞毒性產(chǎn)物之一；生物體內(nèi)MDA進(jìn)一步侵害細(xì)胞生成LF，LF在細(xì)胞生長衰老過程中逐漸積累，是具有光毒性的細(xì)胞內(nèi)沉積物[11]，并造成細(xì)胞損傷，如沉積在動(dòng)物皮膚細(xì)胞中，使皮膚粗糙、黯淡、無光澤，出現(xiàn)皺紋、色斑等。由此可見，上述指標(biāo)（SOD、MDA、LF）是直接關(guān)切生物體內(nèi)“氧化”損害與“抗氧化”的相關(guān)指標(biāo)，而它們有可能是引起或延緩皮膚衰老、皮膚褐斑的關(guān)鍵因素[12～14]。Hyp則大量存在于皮膚的膠原蛋白和彈性蛋白中，膠原蛋白和彈性蛋白都具有一定的防老化和促再生作用，共同維持著皮膚的光滑性、柔順性和彈性，隨著皮膚衰老和老化，兩者含量均有所下降，因此常用皮膚中Hyp含量來作為皮膚衰老的指標(biāo)[15]。而皮膚中膠原蛋白等對(duì)氧自由基十分敏感[16]，原因在于組織中過多的H2O2、OH·、O2-等自由基會(huì)造成成纖維細(xì)胞內(nèi)羥化酶失去羥化功能，則羥脯氨酸生成減少，從而破壞膠原蛋白，因此Hyp含量與體內(nèi)自由基損傷及抗氧化相關(guān)指標(biāo)SOD、MDA、LF等的變化有內(nèi)在關(guān)聯(lián)性[17]。本文中以皮膚衰老指標(biāo)Hyp為應(yīng)變量，以氧化或抗氧化指標(biāo)SOD、MDA、LF為自變量進(jìn)行多元相關(guān)分析，結(jié)果表明兩種指標(biāo)間有密切相關(guān)性；皮膚水分含量的測(cè)定結(jié)果，可進(jìn)一步表征皮膚的老化程度，以及白芷延緩皮膚衰老的活性大小。

本研究表明，白芷醇提物在體內(nèi)、外均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，體內(nèi)抗氧化活性與其延緩皮膚衰老作用有相同的趨勢(shì)和密切相關(guān)性，提示白芷醇提物的抗氧化作用可能為其美白和延緩皮膚衰老作用機(jī)制之一。白芷富含香豆素類、揮發(fā)油類、生物堿類、多糖類和眾多微量元素等多種組分，其中很多成分都可能具有清除自由基的作用，然而究竟哪些組分怎樣發(fā)揮著主要作用，以及各自貢獻(xiàn)多少，筆者以為有必要從細(xì)胞分子水平進(jìn)一步對(duì)白芷醇提物美白作用各種機(jī)制進(jìn)行綜合研究評(píng)價(jià)。同時(shí)由于各活性物質(zhì)極性不同，不同提取部位抗氧化效果也不盡相同，也有必要對(duì)其有效成分的提取工藝做出優(yōu)化和篩選，為指導(dǎo)白芷的臨床合理應(yīng)用以及相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)提供更全面詳細(xì)的資料和參考。

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