楊永軍 張賀翠 楊 昆 薛麗琰 常登龍 朱利泉

（西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院植物生理生化實(shí)驗(yàn)室，重慶 400716）

植物的自交不親和性（self-incompatibility，SI）是其為了避免自花受精而進(jìn)化出的重要遺傳機(jī)制。甘藍(lán)（Brassica oleraceaL.）SI的分子過程是由存在于花粉中的S-位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白（S-locus cystein-rich protein，SCR），亦稱為S位點(diǎn)蛋白11（S-locus protein11，SP11）識別結(jié)合柱頭上的S受體激酶基因（Sreceptor kinase gene，SRK）啟動(dòng)，將原本結(jié)合于SRK上的負(fù)調(diào)控因子類硫氧還蛋白（thioredoxin-like protein，THL）釋放出來，然后通過目前尚未完全知曉的分子過程實(shí)現(xiàn)自交不親和性。SRK由S結(jié)構(gòu)域（S域）、跨膜結(jié)構(gòu)域以及激酶結(jié)構(gòu)域3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成（Stein et al.，1991），SRK的胞外區(qū)域與SCR相識別，且基因序列與SLG具有較高的同源性（Takayama et al.，2001）；其本身又具有較高的多態(tài)性，與S位點(diǎn)緊密連鎖，呈單倍型一致性。根據(jù)S-位點(diǎn)上SLG基因的結(jié)構(gòu)，蕓薹屬自交不親和復(fù)等位基因可分為兩大類：class-Ⅰ自交不親和復(fù)等位基因，SLG沒有內(nèi)含子；class-Ⅱ型S等位基因，SLG基因的3′末端附近有1個(gè)內(nèi)含子（Hatakeyama et al.，1998a；Kusaba & Nishio，1999）。Ⅰ型和Ⅱ型的S基因的分化較早，差異較大（Kusaba et al.，1997），Ⅱ型不同物種的SLG基因之間同源性在86%以上，而Ⅰ型和Ⅱ型SLG基因之間同源性僅60%～70%。Nishio等（1996）根據(jù)這兩類SLG基因序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，通過PCR擴(kuò)增就能將這兩類SLG基因區(qū)分開來。Stein等（1991）發(fā)現(xiàn)，在同一單倍型中S結(jié)構(gòu)域中的SRK與SLG表現(xiàn)出極高的相似性，擁有很相似的單倍型和相似的S位點(diǎn)特異性，在序列上SLG可能與其他相似的SRK單倍型聯(lián)系更加緊密。然而甘藍(lán)S-2和S-6的單倍型數(shù)據(jù)顯示，Ⅱ型與Ⅰ型序列差別很大（Kusaba et al.，1997）。研究還發(fā)現(xiàn)許多甘藍(lán)類作物S等位基因兼有class-Ⅰ和class-Ⅱ型（Chen & Nasrallah，1990；Tantikanjana et al.，1993），在Ⅰ型和Ⅱ型兼有的植物中，所有Ⅱ型S復(fù)等位基因都屬于花粉隱性表現(xiàn)型，包括B. rapa中的S-29、S-40、S-44和S-60單元型（Hatakeyama et al.，1998b；Takasaki et al.，2000）和B. oleracea中的S-2、S-5和S-15單元型（Chen & Nasrallah，1990；Scutt & Croy，1992；Cabrillaca et al.，1999），而大多數(shù) class-Ⅰ型S復(fù)等位基因?qū)儆诨ǚ埏@性表現(xiàn)型（Nasrallah et al.，1991）；研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型的SCR基因?yàn)轱@性基因，Ⅱ型的SCR基因?yàn)殡[性基因，在轉(zhuǎn)錄過程中Ⅱ型的SCR基因的轉(zhuǎn)錄受到了抑制，因此植物表現(xiàn)顯隱性的關(guān)系決定于S位點(diǎn)基因的轉(zhuǎn)錄情況（Shiba et al.，2002）。Ⅰ型和Ⅱ型S等位基因存在較高的保守區(qū)，同時(shí)也存在著較大的差異（Kusaba et al.，1997），這些差異涉及從授粉到受精過程中發(fā)生的花粉配體和雌蕊受體之間的相互作用以及相互作用的強(qiáng)弱關(guān)系（Kachroo et al.，2002；Ivanov et al.，2010）。S位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)不同而使Ⅰ型和Ⅱ型產(chǎn)生差異的分子機(jī)制尚不清楚，甘藍(lán)兩種類型的SRK與其下游的識別因子（SCR和THL1）之間的相互作用是否有區(qū)別，以及它們之間相互作用的強(qiáng)度又有什么關(guān)系還未見報(bào)道。因此建立一個(gè)適用于 class-Ⅱ型配體和受體之間，以及與其下游的THL1/THL2之間的蛋白質(zhì)相互作用平臺，進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用機(jī)理的研究，對控制整個(gè)自交不親和信號傳導(dǎo)途徑，以及確定class-Ⅰ和class-Ⅱ型自交不親和程度具有重要意義。本試驗(yàn)擬構(gòu)建class-Ⅱ型SCR2、eSRK2酵母雙雜交表達(dá)載體和class-Ⅰ型SRKJ激酶域，THL1酵母雙雜交表達(dá)載體，通過其毒性和自激活檢測來確定自交不親和性表型所依賴的3個(gè)起始信號傳導(dǎo)元件之間識別程度的差異，進(jìn)而通過激活酵母雙雜交的報(bào)告基因所表達(dá)的多少來確定其相互作用程度。并通過生物信息學(xué)分析確定其Ⅰ型和Ⅱ型歸屬，以期能確定class-Ⅱ型內(nèi)部的eSRK-SCR的互作及其與class-Ⅰ型之間THL、SCR與SRK存在的相互作用及其作用程度，為深入研究甘藍(lán)自交不親和性信號傳導(dǎo)分子過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2011年7月～2012年1月在西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院植物生理生化實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。甘藍(lán) B3、E1、D3是西南大學(xué)蔬菜學(xué)實(shí)驗(yàn)室選育的材料。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。EcoRⅠ、SmaⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶購自 TaKaRa公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自TransGen公司。酵母雙雜交系統(tǒng)（Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System）、x-α-gal、Aureobasidin A（以下簡稱AbA）及酵母培養(yǎng)基購自Clontech公司。DMSO購自Sigma公司。

1.2 SCR2、eSRK2、THL1的擴(kuò)增

根據(jù)SCR2、eSRK2和THL1基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別構(gòu)建SCR2、eSRK2、THL1基因序列片段。依據(jù)GenBank中編號為AB067447的SP11-2序列和編碼為AJ306585的SRK序列分析和酶切圖譜，結(jié)合載體pGBKT7和pGADT7的多克隆位點(diǎn)，利用primer premier 6.0設(shè)計(jì)相應(yīng)的RT-PCR引物。SCR2擴(kuò)增的是第2個(gè)外顯子。eSRK2正向引物從成熟肽第1個(gè)氨基酸開始，并去掉信號肽；反向引物是依據(jù)eSRK-3、eSRK-7、eSRK-15、eSRK-28、eSRK-6、eSRK-36、eSRK-18、eSRK-12、eSRK-60、eSRK-2設(shè)計(jì)的特異引物（表1）。另外，參照劉東等（2003）擴(kuò)增的引物和條件，擴(kuò)增THL1編碼序列。SRK6（SRKJ）激酶域、eSRK28分別來自張賀翠等（2011）、楊紅等（2011）。

以反轉(zhuǎn)錄的花藥cDNA為模板擴(kuò)增SCR2、eSRK2和THL1片段，eSRK2片段反應(yīng)參數(shù)為94 ℃2 min；94 ℃ 2 min，55 ℃ 2 min，72 ℃ 45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min 終止。以反轉(zhuǎn)錄的柱頭cDNA為模板擴(kuò)增eSRK2片段，反應(yīng)參數(shù)為94 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min，59 ℃ 60 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min 終止。THL1片段的反應(yīng)參數(shù)為 94 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min，52 ℃ 2 min，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min終止。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，以DNA膠回收試劑盒純化回收。

表1 擴(kuò)增SRK的S結(jié)構(gòu)域和SCR的引物

1.3 酵母雙雜交重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ和SmaⅠ對擴(kuò)增產(chǎn)物SCR2、THL1和酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7進(jìn)行雙酶切；用EcoRⅠ和BamHⅠ對eSRK2、SRKJ和酵母表達(dá)質(zhì)粒pGADT7進(jìn)行雙酶切；SCR2、THL1片段與pGBKT7連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB平板上（含Kan+抗性）；eSRK2、SRKJ片段與pGADT7連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于LB平板上（含Amp+抗性）。37 ℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性重組子，并進(jìn)行菌液PCR和酶切鑒定，將含有插入目的片段的陽性克隆送北京華大基因研究中心測序。序列正確的重組質(zhì)粒分別命名為pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1、pGADT7-eSRK2和 pGADT7-SRKJ。

1.4 重組酵母雙雜交表達(dá)質(zhì)粒的毒性檢測

根據(jù)酵母雙雜交系統(tǒng)使用說明書（Matchmaker? Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual），采用LiAc法制備感受態(tài)酵母菌Y2HGold和Y187。用PEG/LiAc法將pGBKT7空載和重組誘餌載體pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1同時(shí)轉(zhuǎn)化 Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，30 ℃培養(yǎng) 3～5 d，觀察其在SD/-Trp篩選平板上的生長情況。采用同樣的方法將pGADT7空載和重組AD質(zhì)粒pGADT7-eSRK2、pGADT7-SRKJ轉(zhuǎn)化Y187感受態(tài)細(xì)胞，觀察其在SD/-Leu平板上的生長情況。

1.5 重組誘餌載體的自激活檢測

用PEG/LiAc法將pGBKT7-SCR2轉(zhuǎn)化Y2HGold酵母感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/xα-gal、SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板上；將 pGADT7-eSRK2轉(zhuǎn)化 Y187感受態(tài)細(xì)胞，分別涂布于SD/-Leu、SD/-Leu/x-α-gal平板上，30 ℃倒置培養(yǎng) 3～5 d，觀察 pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1在選擇平板上的生長情況。以 pGBKT7-Lam×pGADT7-T為陰性對照，以 pGBKT7-p53×pGADT7-T為陽性對照。

1.6 SRKJ與 THL1、SCR2與 eSRK2、eSRK28與 SCR2、eSRK28與 SCR28相互作用檢測

分別挑取SD/-Trp、SD/-Leu平板上的菌落，將含有SCR2和eSRK2片段的pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2轉(zhuǎn)化菌落組合，同時(shí)接種于500 μL的2×YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)18～20 h，在顯微鏡下檢測 Y2HGold與 Y187交配形成二倍體接合型的情況。以 pGBKT7-Lam×pGADT7-T為陰性對照，以 pGBKT7-p53×pGADT7-T為陽性對照。然后將融合菌液涂布到SD/-Trp-Leu（DDO）、SD/-Trp-Leu/x-α-gal/AbA（DDO/x/A）平板上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d。最后將DDO/x/A平板上的藍(lán)色克隆劃線至SD/-His-Trp-Leu（TDO）、SD/-His-Trp-Leu/x-α-gal/AbA（TDO/x/A）和 SD/-Trp-Leu-Ade（TDO）、SD/-Trp-Leu-ura/x-α-gal/AbA（TDO/x/A）和SD/-Trp-Leu-Ade-His/x-α-gal/AbA（QDO/x/A）平板，觀察其生長情況。

采用同樣的方法檢測 eSRK2×THL1、eSRK28×SCR2、SRKJ×THL1、eSRK28×SCR28在 DDO、DDO/x/A平板上的生長情況；然后將DDO/x/A平板上的藍(lán)色克隆劃線至TDO、TDO/x/A或TDO、TDO/x/A和QDO/x/A平板，觀察其生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 class-Ⅰ型的SCR、eSRK和class-Ⅱ型的SCR、eSRK的基因克隆及序列分析

擴(kuò)增的eSRK2位于第1個(gè)外顯子的74～1321 bp之間，編碼了416個(gè)氨基酸。應(yīng)用Vector NTI Advance分析Ⅰ型和Ⅱ型的SRK氨基酸序列（圖1），發(fā)現(xiàn)其序列相似性在48.6%～84.2%之間，class-Ⅱ型的 eSRK之間的蛋白序列相似性要高于 class-Ⅰ型。class-Ⅱ型中的S-2、S-5和S-15之間的序列相似性達(dá)到93.0%～97.3%；class-Ⅰ型的單倍型S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之間蛋白質(zhì)序列比classⅡ型的序列相似性低。由此推斷，蛋白序列的不同是造成自交不親和性的主要原因之一。比對結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型和Ⅱ型的氨基酸序列在219～330 bp的氨基酸區(qū)間和446～460 bp的氨基酸區(qū)間呈現(xiàn)較大的差異，class-Ⅰ型的氨基酸存在部分缺失。

圖1 甘藍(lán)class-Ⅰ型和class-Ⅱ型eSRK氨基酸序列比對分析結(jié)果

本試驗(yàn)擴(kuò)增的是SCR2的第2個(gè)外顯子，共編碼65個(gè)氨基酸。應(yīng)用Vector NTI Advance分析SCR氨基酸序列（圖 2）。class-Ⅰ型中不同單倍型 SCR氨基酸的相似度為 20%～76%；class-Ⅱ型中不同單倍型SCR蛋白質(zhì)序列兩兩之間的相似度達(dá)到63%～94%。class-Ⅰ型SCR的4個(gè)半胱氨酸殘基高度保守，另外4個(gè)半胱氨酸殘基所處的位置略有差異；而class-Ⅱ型SCR的8個(gè)半胱氨酸殘基高度保守。Ⅰ型的SCR、eSRK和Ⅱ型的SCR、eSRK在蛋白質(zhì)序列上存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致了自交不親和蛋白結(jié)構(gòu)和功能的差異，表現(xiàn)為不同的自交不親和強(qiáng)度。

eSRK2、SCR2及THL1的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別約為 1200 bp（圖 3）、200 bp（圖 4）和 400 bp（圖5）。經(jīng)純化和測序后得出，eSRK2、SCR2和THL1的序列長度分別為195、1248、430 bp，與電泳結(jié)果一致。序列分析發(fā)現(xiàn)，SCR2與SCR（GB|AB067447|）的序列完全一致；eSRK2與eSRK2D（GB|AJ306585|）的序列完全一致；THL1與劉東等（2003）的序列完全一致。

圖2 甘藍(lán)class-I型和class-Ⅱ型SCR氨基酸序列比對分析結(jié)果

圖3 eSRK2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒 pGADT7-eSRK2、pGBKT7-SCR2、pGADT7-SRKJ 和 pGBKT7-THL1的構(gòu)建及酶切鑒定

提取篩選的陽性克隆質(zhì)粒DNA并進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳檢測得到與eSRK2、SCR2、SRKJ、THL1大小一致的片段（圖 6），表明載體構(gòu)建成功。DNA測序結(jié)果分析表明，pGBKT7-eSRK2載體中包含的eSRK2片段序列、插入位點(diǎn)和讀框正確，且插入的eSRK2片段序列與目的序列完全一致。pGBKT7-SCR2載體中包含的SCR2片段序列、插入位點(diǎn)和讀碼框正確，且插入的SCR2片段序列與SCR2（SP11-2）序列完全一致。pGADT7-SRKJ和pGBKT7-THL1載體中包含的SRKJ和THL1片段序列、插入位點(diǎn)和讀碼框正確，且插入的SRKJ和THL1片段序列與SRKJ和THL1序列完全一致。

圖4 SCR2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖5 THL2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M，Trans2K PlusⅡDNA marker；1，THL1。

圖6 pGBKT7-eSRK2的EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切，pGBKT7-SCR2、pGADT7-SRKJ和pGBKT7-THL1的EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切圖譜

2.3 誘餌蛋白毒性及其自激活檢測分析和pGBKT7-SRK毒性檢測分析

將 pGBKT7-SCR2質(zhì)粒、pGBKT7-THL1質(zhì)粒、空載對照pGBKT7質(zhì)粒用LiAc法轉(zhuǎn)化酵母雙雜交報(bào)告菌株Y2HGold中，而后接種于SD/-Trp、SD/-Trp/x-a-gal、SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d。pGBKT7-SCR2質(zhì)粒在SD/-Trp（未附圖）和SD/-Trp/x-a-gal（圖7-c-2）平板上產(chǎn)生白色菌落；pGBKT7-THL1質(zhì)粒在SD/-Trp（未附圖）和SD/-Trp/x-a-gal（圖7-d-2）平板上出現(xiàn)了生長狀態(tài)良好、菌斑與空載pGBKT7（圖7-c-1）大小相近、菌斑密度均無明顯差異的白色克隆，證明轉(zhuǎn)入的表達(dá)蛋白對酵母無毒害作用。經(jīng)酵母菌落 PCR鑒定，證明誘餌載體pGBKT7-SCR2、pGBKT7-THL1已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到酵母中。pGBKT7-SCR2和 pGBKT7-THL1在 SD/-Trp/x-α-gal/AbA平板上沒有菌落生長（未附圖）。陽性對照 pGBKT7-p53×pGADT7-T有明顯的藍(lán)色克隆子出現(xiàn)，而陰性對照pGBKT7-Lam×pGADT7-T無克隆子出現(xiàn)（圖7-b）。表明含有pGBKT7-SCR2和pGBKT7-THL1質(zhì)粒的酵母細(xì)胞沒有激活報(bào)告基因AUR1-C和MEL1，沒有發(fā)生自身的轉(zhuǎn)錄激活作用。

圖7 重組質(zhì)粒pGBKT7-SCR2自激活作用和毒性檢測及誘餌質(zhì)粒pGADT7-eSRK2的毒性檢測結(jié)果

將pGADT7空載、pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2轉(zhuǎn)化Y187，觀察到它們都能在SD/-Leu平板上良好的生長。pGADT7-SRKJ（圖7-d-1）和pGADT7-eSRK2（圖7-a-2）在SD/-Leu平板上生長狀態(tài)良好。而且其對照 pGADT7（圖 7-a-1）斑點(diǎn)大小及生長時(shí)間與 pGADT7-eSRK2和pGADT7-SRKJ一致，說明表達(dá)蛋白對酵母菌無毒害作用。經(jīng)酵母菌落 PCR鑒定，證明誘餌載體pGADT7-eSRK2和pGADT7-SRKJ已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化到酵母中。

2.4 SCR2與 eSRK2、eSRK28與 SCR2、SRKJ 與 THL1相互作用檢測

將 3 個(gè)組合 Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕、Y2HGold〔pGBKT7- SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕、Y2HGold〔pGBKT7-SCR28〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕和 Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕都轉(zhuǎn)到DDO平板上，均能出現(xiàn)生長狀態(tài)良好的菌斑，表明雙雜交重組表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入二倍體接合型酵母菌中。同時(shí)用 3個(gè)組合中片段相應(yīng)的引物組合對 DDO平板上的菌落進(jìn)行酵母菌液 PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一單菌落有明顯的SCR2和eSRK2、SRKJ和THL1目的片段；Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕未檢測出目的片段，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒 pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2、pGADT7-SRKJ×pGBKT7-THL1成功轉(zhuǎn)入二倍體接合型酵母菌中。組合 Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕和Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕都能在DDO/x/A平板上長出明顯的藍(lán)色菌落（表2），表明這2個(gè)組合激活了報(bào)告基因AUR1-C和MEL1；Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕在DDO/x/A平板上未長出藍(lán)色菌落，初步判斷沒有相互作用。為更進(jìn)一步檢測相互作用的可能性，排除假陽性和假陰性的出現(xiàn)，將 DDO/x/A平板上的藍(lán)色克隆劃線至TDO/x/A和QDO/x/A平板上，4 d后發(fā)現(xiàn)涂有Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK2〕的TDO/x/A在平板上呈藍(lán)色，而QDO/x/A平板上酵母菌株沒有生長的跡象，表明報(bào)告基因HIS3也能被激活，而報(bào)告基因ADE未激活（圖8）。Y187〔pGADT7-SRKJ〕×Y2HGold〔pGBKT7-THL1〕和 Y2HGold〔pGBKT7-SCR28〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕在 TDO/x/A和 QDO/x/A平板上都呈藍(lán)色，表明報(bào)告基因HIS3和ADE被激活。Y2HGold〔pGBKT7-SCR2〕×Y187〔pGADT7-eSRK28〕的融合株在三缺平板和四缺平板上都沒有生長，證明了不同單倍型之間沒有相互作用。

表2 酵母中SCR2與eSRK2、eSRK28與SCR2、SRKJ與THL1相互作用的檢測結(jié)果

續(xù) 表

與楊紅等（2011）對于class-Ⅰ型的研究結(jié)果進(jìn)行對比分析（表 3），更加系統(tǒng)的說明了自交不親和Ⅰ型和Ⅱ型不同的相互作用關(guān)系，即酵母中報(bào)告基因表達(dá)的數(shù)目和類型的差異反映了class-Ⅱ內(nèi)部的SCR-SRK和class-Ⅰ型的SCR-SRK的互作強(qiáng)度，Ⅰ型高于Ⅱ型；THL與SRK之間存在較高的互作強(qiáng)度。

圖8 酵母融合株在QDO/x/A和TDO/x/A平板上相互作用檢測結(jié)果

表3 酵母雙雜交中class-Ⅰ型和class-Ⅱ型不同的相互作用關(guān)系

3 結(jié)論與討論

酵母的基因組中有一種特殊的上游激活序列（upstream activating sequence，UAS），在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因AUR1-C、HIS3、ADE2、lacZ和MEL1表達(dá)，它與激活蛋白結(jié)合大大增加了下游基因的轉(zhuǎn)錄速度。GAL4為酵母UAS的結(jié)合蛋白，它的正常結(jié)合可以激活UAS下游基因的轉(zhuǎn)錄。GAL4有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，BD）和C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptional activating domain，AD）。GAL4蛋白的兩個(gè)結(jié)合域分開時(shí)不能激活UAS下游基因的轉(zhuǎn)錄，只有將這兩部分通過適當(dāng)?shù)耐緩竭B在一起后才能恢復(fù)激活轉(zhuǎn)錄的活性。如果BD連上1個(gè)誘餌蛋白（bait），AD上接1個(gè)獵物蛋白（prey），當(dāng)誘餌蛋白和獵物蛋白發(fā)生互作，則BD和AD因距離靠近或結(jié)合在一起形成的完整的GAL4蛋白，激活下游報(bào)道基因的表達(dá)。在酵母菌 Y2HGold中受 3個(gè)不同的啟動(dòng)子作用，通過不同的操縱基因調(diào)節(jié) 4個(gè)完整的報(bào)告基因AUR1-C、HIS3、ADE2和MEL1，酵母菌Y187中有2個(gè)報(bào)告基因MEL1和lacZ；誘餌蛋白和獵物蛋白的互作強(qiáng)度與整個(gè)基因之間的相互作用強(qiáng)度存在必然的聯(lián)系。根據(jù)酵母雙雜交系統(tǒng)可以提出假設(shè)：由于誘餌蛋白和獵物蛋白的相互作用強(qiáng)度差異，使下游啟動(dòng)子對報(bào)告基因啟動(dòng)的數(shù)目不同，再由酵母雙雜交試驗(yàn)得出結(jié)果，從而探討class-Ⅰ型和class-Ⅱ型以及與THL1自交不親和程度關(guān)系。結(jié)果顯示，class-Ⅱ型中能夠激活的報(bào)告基因要比 class-Ⅰ型要少，證明了 3個(gè)啟動(dòng)子存在不同的啟動(dòng)強(qiáng)度，激活不同數(shù)目的報(bào)告基因。

甘藍(lán)中存在自交不親和機(jī)制，根據(jù)S位點(diǎn)的基因結(jié)構(gòu)不同可以將其分為兩類，class-Ⅰ型和class-Ⅱ型，然而它們產(chǎn)生差異的分子機(jī)制尚不清楚。有研究表明，SCR與 SRK胞外結(jié)構(gòu)域之間的親和力很高（Shimosato et al.，2007），SLG僅通過與SRK胞外S結(jié)構(gòu)域聚集而起輔助受體的作用（Cui et al.，2000；Takasaki et al.，2000；Silva et al.，2001）來進(jìn)一步提高這種親和力，因此SRK與SCR之間的識別速度和結(jié)合強(qiáng)度與自交不親和性的強(qiáng)弱類型直接成正相關(guān)，當(dāng)SRK與SCR之間識別快而強(qiáng)時(shí)，表現(xiàn)為Ⅰ類自交不親和性的諸多亞類型；當(dāng)SRK與SCR之間識別慢而弱時(shí)，表現(xiàn)為Ⅱ類自交不親和性的諸多亞類型。Bower等（1996）利用酵母雙雜交技術(shù)從甘藍(lán)柱頭cDNA文庫篩選出SRK下游因子類硫氧還蛋白1/2（THL1/THL2）。Ivanov等（2010）研究證明了SRK是自交不親和信號傳導(dǎo)的核心因子，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)。Kachroo等（2002）和Ivanov等（2010）提出自交不親和的信號通路是：在甘藍(lán)開花時(shí)期THL1/THL2與SRK激酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而抑制其激酶活性，當(dāng)花粉落到柱頭上后，相同單倍型SCR與SRK胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，致使 SRK構(gòu)象變化，使其釋放原本結(jié)合在激酶結(jié)構(gòu)域的THL1/THL2，激活SRK激酶域活性，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)引發(fā)次級級聯(lián)反應(yīng)，繼續(xù)傳遞來自細(xì)胞外的信號，并最終導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)的發(fā)生。這樣自交不親和反應(yīng)中的SCR、THL與SRK之間就存在一個(gè)交替互作的關(guān)系，也為本試驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)探討兩類SRK之間的SCR-SRK-THL的交替相互作用的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

S單倍型之間的S基因的高度多態(tài)性是蕓薹屬自交不親和性以多種類型存在的分子原因（Castric & Vekemans，2007；Edh et al.，2008）。Edh等（2009）將 class-Ⅱ型的S單倍型與class-Ⅰ型的S單倍型的SP11、SLG和SRK的核苷酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)class-Ⅱ型的序列更加保守；對class-Ⅱ型的S-60單倍型的研究發(fā)現(xiàn)，class-Ⅱ型的S-60單倍型與class-Ⅰ型截然不同，而且在S-60中SCR、SRK和SLG的位置與class-Ⅰ型的S-910完全不相同。經(jīng)氨基酸序列比較分析，發(fā)現(xiàn) class-Ⅱ型的氨基酸多樣化程度明顯要比 class-Ⅰ型小得多。class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的SCR、SLG和SRK序列上的差異導(dǎo)致了class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的不同，這些不同有助于有效地抑制兩者和不同的S單倍型之間的重組。Kristina等（2009）分析S結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化起源時(shí)，根據(jù)甘藍(lán)的優(yōu)勢地位，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析SRK激酶結(jié)構(gòu)域得到一個(gè)緊密的關(guān)系，并將其分成了class-Ⅰa型、class-Ⅰb型和class-Ⅱ型，這個(gè)結(jié)論重新定義了class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的關(guān)系。在關(guān)于class-Ⅰ型的研究中class-Ⅰb型的單體型占有的主導(dǎo)優(yōu)勢要低一些，它處在class-Ⅰa單體型和class-Ⅱ單體型之間。經(jīng)過不斷的試驗(yàn)和總結(jié)，Billiard等（2007）定義了一個(gè)優(yōu)勢等級，提出這樣一個(gè)理論模型：認(rèn)為在柱頭共顯性和在花粉中的優(yōu)勢序位是class-Ⅰa＞class-Ⅰb＞class-Ⅱ。自交不親和越強(qiáng)就意味著它能夠更有力的阻止自身的花粉與柱頭受精、預(yù)防近親繁殖和促進(jìn)遠(yuǎn)系雜交，保持遺傳多樣性，筆者利用酵母雙雜交試驗(yàn)證明了兩類相互作用的程度不同，驗(yàn)證了上面提出的理論優(yōu)勢序位，證實(shí)了相互作用的程度class-Ⅰ型＞class-Ⅱ型。

SRK作為柱頭S基因，與SCR識別的胞外S結(jié)構(gòu)域編碼區(qū)變異性較大（Takayama et al.，2001），兩者之間的這種較大的變異性，在進(jìn)化上賦予了S單倍型的多態(tài)性；而負(fù)責(zé)同下游功能蛋白作用的C-端激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)變異性卻較小，說明在進(jìn)化上賦予了其下游功能蛋白所決定的是一個(gè)目前尚未完全知曉的共同信號傳導(dǎo)過程（Samuel et al.，2008）。張賀翠等（2011）擴(kuò)增了不同亞種的ARC1基因，利用酵母雙雜交證明都能與SRK激酶域發(fā)生互作，也證明了SRK的C-端激酶結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的區(qū)域。本試驗(yàn)中利用酵母雙雜交技術(shù)證明了組合SRKJ與THL1在四缺平板（QDO/x/A）上能夠生長，存在相互作用，并激活了全部的 4個(gè)報(bào)告基因，由于C-端激酶結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)變異性較小甚至不存在什么變化，所以SRK2激酶域也能夠和THL1相互作用，激活了全部的4個(gè)報(bào)告基因。另外，Luo等（2011）以甘藍(lán)材料D3、B3、E1、A1、H1、230、240、243、N1、G1的柱頭和花粉cDNA為模板，擴(kuò)增了甘藍(lán)的SRK胞外域序列（eSRK3），利用酵母雙雜交技術(shù)證明了D3材料中的eSRK與SCR蛋白之間以及E1材料中的eSRK與SCR蛋白之間能夠相互結(jié)合，但E1材料中的eSRK與D3材料中的SCR蛋白之間以及D3材料中的eSRK與E1材料中的SCR蛋白之間不相互結(jié)合，為深入研究eSRK-SCR作用位點(diǎn)建立了一個(gè)技術(shù)平臺，也證明了class-Ⅰ型S-3中的SRK和SCR存在相互作用。楊紅等（2011）和本試驗(yàn)利用酵母雙雜交技術(shù)證明了S-28中的SCR與eSRK存在相互作用，且其相互作用區(qū)域位于SCR28（GenBank AB190356）的 1876～2052 bp、eSRK28（GenBank AB190356）的 418～1276 bp 區(qū)域。同時(shí)，也指出了SRK跨膜域的存在與否對SCR與SRK相互作用沒有影響；SCR-SRK復(fù)合體的S單倍型特異性導(dǎo)致了SI反應(yīng)的特異性。這充分說明利用酵母雙雜交技術(shù)可以證明class-Ⅰ型自交不親和復(fù)等位基因的SCR和eSRK存在相互作用，而class-Ⅱ型S等位基因是否也存在同樣的相互作用，以及class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的相互作用程度關(guān)系，卻并不了解。

本試驗(yàn)選擇了一個(gè)新的思路，將SCR-SRK-THL之間存在的相互作用做了一個(gè)縱向的研究，以試驗(yàn)中出現(xiàn)的激活不同報(bào)告基因的個(gè)數(shù)來提出假設(shè)，以試驗(yàn)結(jié)果推斷 class-Ⅰ型和 class-Ⅱ型的相互作用程度關(guān)系，利用酵母雙雜交技術(shù)初步確定 PGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK2之間存在相互作用，說明class-Ⅱ型自交不親和復(fù)等位基因激活了編碼AUR1-C、MEL1和HIS3報(bào)告基因，卻未激活編碼ADE2報(bào)告基因。由于激酶域的高度相似性，認(rèn)為class-Ⅱ型SRK2激酶域與THL1之間的相互作用也可以激活 4個(gè)報(bào)告基因。對照 pGBKT7-SCR2×pGADT7-eSRK28的融合株在TDO/x/A平板上不能生長，說明不同單倍型中的SCR與eSRK并不存在相互作用。再結(jié)合楊紅等（2011）對于class-I型的相互作用的研究結(jié)果，以class-Ⅰ型和class-Ⅱ型的相互作用激活3個(gè)起始信號傳導(dǎo)元件，而它們之間的識別程度差異表現(xiàn)為不同數(shù)量、種類的報(bào)告基因，使其在不同的氨基酸缺陷平板上生長，分析 class-Ⅰ型和 class-Ⅱ型與 THL1的相互作用關(guān)系。結(jié)果表明Ⅰ型的SCR-eSRK激活了4個(gè)報(bào)告基因；Ⅱ型的SCR-eSRK由于啟動(dòng)子的啟動(dòng)強(qiáng)度較Ⅰ型弱，激活了3個(gè)報(bào)告基因；由于S位點(diǎn)激酶域的高度保守性，兩類SRK（激酶域）的變異性較小，所以SRK（激酶域）-THL1都能激活4個(gè)報(bào)告基因，利用酵母雙雜交試驗(yàn)檢測了甘藍(lán)SCR、THL和SRK之間交替相互作用的關(guān)系。這一結(jié)果也證明了酵母雙雜交系統(tǒng)對于class-Ⅱ型自交不親和復(fù)等位基因的相互作用檢測同樣適用，這樣也從一個(gè)側(cè)面進(jìn)一步完善了酵母雙雜交系統(tǒng)。

class-Ⅰ型的SCR-eSRK和SRK激酶域與THL1之間的相互作用激活了4個(gè)報(bào)告基因，即編碼AUR1-C、MEL1、ADE2、HIS3的基因，class-Ⅱ型的SCR-eSRK之間的相互作用由于誘餌載體與獵物載體蛋白的結(jié)合能力不同，使得激活3個(gè)啟動(dòng)子的能力不同，激活了3個(gè)報(bào)告基因，即編碼AUR1-C、MEL1、HIS3的基因，ADE2的基因未激活。class-Ⅱ型 SRK2激酶域與 THL1之間的相互作用也可以激活4個(gè)報(bào)告基因。class-Ⅰ型之間和class-Ⅱ型之間不存在相互作用。初步認(rèn)為，class-Ⅰ型的自交不親和性強(qiáng)于class-Ⅱ型；利用酵母雙雜交技術(shù)同樣可以鑒定class-Ⅱ型之間存在的相互作用，Ⅰ型強(qiáng)于Ⅱ型，甘藍(lán) SCR-SRK-THL存在一個(gè) SCR-SRK、SRK-THL交替相互作用的關(guān)系。

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