羅 玲，李海濤，劉東明，高繼國

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種分布極其廣泛且在其生活史中能形成芽胞和產(chǎn)生多種蛋白晶體的革蘭氏陽性細(xì)菌[1]。Bt是當(dāng)今微生物農(nóng)藥中研究最為深刻、應(yīng)用最為廣泛、對環(huán)境最為友善、商業(yè)化程度最高的微生物殺蟲劑[2-3]。因此，利用Bt基因可以大量減少化學(xué)殺蟲劑的使用[4-5]。目前已報(bào)道的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal protein,ICPs），也稱δ-內(nèi)毒素（delta-endotoxin），有564種，分為68類Cry蛋白和3類Cyt蛋白，分屬229種模式蛋白[6]。它的形狀、結(jié)構(gòu)和大小均與其毒力有著密切關(guān)系[7]。Cry晶體蛋白被敏感幼蟲吞食后，在幼蟲腸道堿性環(huán)境和蛋白酶的作用下釋放出活性毒素，可與昆蟲中腸上皮細(xì)胞的特異受體結(jié)合并形成孔道，破壞細(xì)胞滲透壓平衡，最終導(dǎo)致昆蟲死亡[8]。因此，對殺蟲晶體蛋白的挖掘及研究具有非常重要的實(shí)際價(jià)值。目前已有多種cry基因用于高效廣譜殺蟲工程菌的構(gòu)建和殺蟲轉(zhuǎn)基因植物的培育，部分商品化的工程菌和轉(zhuǎn)基因植物已帶來明顯的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。由于Bt基因在構(gòu)建殺蟲工程菌株和轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)用中的巨大潛力，有關(guān)高毒力和新型殺蟲活性的cry基因的分離、克隆及開發(fā)研究已成為國內(nèi)外Bt研究和利用的一大熱點(diǎn)。

最近幾年，已有一些Bt菌株從東北地區(qū)的多個(gè)自然保護(hù)區(qū)中被分離出來，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所合作，從黑龍江省五常市拉林鎮(zhèn)附近分離到一株Bt菌株LS-R-21，并從該菌株中分離出基因cry1Aa，進(jìn)行了序列比對分析，在大腸桿菌中進(jìn)行了基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性測定結(jié)果表明該基因?qū)[翅目菜蛾科小菜蛾（Plutella xylostella）具有較高毒力。本研究通過對LS-R-21分離株進(jìn)行形態(tài)和遺傳特性分析，為LS-R-21分離株作為防治鱗翅目害蟲的生物農(nóng)藥菌株，及培育轉(zhuǎn)基因抗蟲作物奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌JM109及Rosetta（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)載體pEB由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，加水定容至1 000 mL，pH 7.2，15磅滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入1.3%瓊脂粉。

1.1.3 主要試劑

TaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、dNTP購自TaKaRa公司，KOD高保真酶購自TOYOBO公司，PCR引物由上海生工公司合成，DNA凝膠回收試劑盒和DNA連接酶購自上海生工公司。其他藥品均為國產(chǎn)分析純化以上產(chǎn)品。

1.1.4 供試?yán)ハx

小菜蛾（Plutella xylostella）是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供的標(biāo)準(zhǔn)化試蟲。

1.2 方法

1.2.1 Bt LS-R-21菌株晶體形態(tài)的觀察

將Bt LS-R-21菌株接種于1/2 LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行涂片、烘干固定，石炭酸復(fù)紅染液染色3 min，清水沖洗，100倍油鏡進(jìn)行鏡檢。

1.2.2 PCR-RFLP體系鑒定Btcry基因

參照文獻(xiàn)[9-12]的方法進(jìn)行。

1.2.3cry1Aa全長基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)已公布的cry1Aa類基因的全長序列，通過其同源性的比較，設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增全長序列的引物：

上游引物（1-5）：5′ATGGATAACAATCCGAAC ATC 3′

下游引物（1-3）：5′TTCCTCCATAAGGAGTAA TTCC 3′

PCR熱循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃聚合4 min，循環(huán)30次；72℃聚合10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物于0.7%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

回收KOD plus擴(kuò)增所得cry1Aa全長基因的PCR產(chǎn)物，及pEB載體用EcoⅠ30Ⅰ進(jìn)行單酶切的產(chǎn)物，兩者4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入CaCl2法轉(zhuǎn)化制備的感受態(tài)E.coliJM109中，涂布在氨芐抗性的LB平板上，37℃、12 h，PCR鑒定及酶切分析，篩選出含cry1Aa基因的陽性重組質(zhì)粒。

1.2.5 序列測定及分析

選取陽性重組克隆由大連寶生物工程有限公司完成序列測定，用NCBI BLAST、DNAMAN等軟件分析序列。

1.2.6cry1Aa基因在大腸桿菌中的表達(dá)

將獲得的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliRosetta（DE3）中，230 r·min-1、37 ℃培養(yǎng)。加入0.5 mmol·L-1IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，20 mmol·L-1Tris-HCL懸浮后超聲破碎，離心收集上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測分析[13]。同時(shí)用0.5 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)含pEB空載體轉(zhuǎn)化的Rosetta（DE3）作為陰性對照。

1.2.7 Cry1Aa蛋白殺蟲生物活性測定

將甘藍(lán)葉片用清水洗凈晾干，選取鮮嫩一致的甘藍(lán)葉片，在稀釋好的待測樣品中（濃度梯度為 0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 μg·mL-1）浸泡10 s，晾干，放入生測瓶中，每瓶接3齡幼蟲20頭，每個(gè)處理重復(fù)3次，放置25℃養(yǎng)蟲室中，48 h后檢查幼蟲死亡情況，所得數(shù)據(jù)用POLO軟件分析，計(jì)算LC50。以Cry1Ac蛋白為陽性對照，滅菌水為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt LS-R-21菌株生物學(xué)特性的分析

Bt LS-R-21菌株半胞晶體形態(tài)的觀察見圖1。

由圖1可知，Bt LS-R-21在LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)48 h可見菌落呈乳白色，表面粗糙不透明，邊緣不整齊。挑取單菌落少量，制片，油鏡下觀察，可見伴飽晶體形態(tài)為大小不一的菱形。

圖1 Bt LS-R-21菌株的晶體形態(tài)Fig.1 Shape of crystal of Bt LS-R-21

2.2 Bt LS-R-21菌株cry基因類型的鑒定

對菌株LS-R-21進(jìn)行基因型的PCR-RFLP鑒定，用cry1類基因鑒定引物K5un2/K3un2獲得了大小為1.6 kb的PCR產(chǎn)物，將其進(jìn)行PstⅠ/XbaⅠ雙酶切分析，獲得了RFLP圖譜（見圖2），從此圖可以看出，擴(kuò)增獲得的1.6 kb PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后產(chǎn)生了2個(gè)酶切片段，大小分別為1 117和518 bp，根據(jù)Kuo等表明[10]，LS-R-21中含有cry1Aa基因。

2.3 cry1Aa全長基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)cry1Aa類基因的全長引物L(fēng)5unx/L3unx，擴(kuò)增得到cry1Aa3.6 kb的全長基因，將其與載體pEB進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)JM109中，經(jīng)抗性篩選、PCR鑒定及SmaⅠ和SalⅠ雙酶切分析，篩選出含有cry1Aa基因的陽性重組質(zhì)粒。圖3為陽性重組質(zhì)粒酶切分析及PCR鑒定結(jié)果，經(jīng)SmaⅠ和SalⅠ酶切后，得到大小為5.7 kb的載體條帶和3.6 kb全長基因條帶，說明該表達(dá)載體構(gòu)建正確，將其命名為pEB-cry1Aa。

圖2 Bt LS-R-21菌株cry1類基因的PCR鑒定與PCR-RFLP酶切檢測電泳Fig.2 PCR detection and PCR-RFLP patterns of cry1 from Bt LS-R-21

圖3 pEB-cry1Aa的酶切分析與PCR鑒定Fig.3 Restriction analysis and PCR detection of pEB-cry1Aa

2.4 cry1Aa基因的序列測定及分析

通過DNAMAN軟件分析cry1Aa測序結(jié)果，推導(dǎo)的氨基酸結(jié)果如圖4所示。

由DNA序列推導(dǎo)的氨基酸為1 175個(gè)，由該蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析表明亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）三種氨基酸含量最高，分別占總數(shù)的8.68%、7.74%、7.32%,。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為132.9964 ku，等電點(diǎn)為4.805，此蛋白為弱酸性蛋白質(zhì)。利用ANTHEPROT6.0軟件，采用Garnier方法，由此氨基酸組成推導(dǎo)出Cry1Aa19的二級結(jié)構(gòu)，H代表螺旋，S代表折疊，T代表轉(zhuǎn)角，C代表其他松散結(jié)構(gòu)，它們所占比例分別為25.7%、11.6%、36.10%和26.56%。該基因已在國際基因庫GenBank中注冊，登記號為HQ685121，并經(jīng)Btδ-內(nèi)毒素基因國際命名委員會正式命名為cry1Aa19。

圖4 通過DANMAN軟件分析推導(dǎo)的氨基酸結(jié)果Fig.4 Amino acid results by DNAMAN software

NCBI Blast比對該蛋白氨基酸序列與其他cry1Aa基因氨基酸的差異，通過vector NTI軟件分析，結(jié)果表明，該蛋白與已公布的18種Cry1Aa蛋白的氨基酸序列多數(shù)存在差異，與Cry1Aa7差異最大，有33個(gè)氨基酸殘基不同，與其同源性僅為97.19%。2010年國際Bt殺蟲晶體蛋白命名委員會將其命名為Cry1Aa19。cry1Aa19與其他cry1Aa基因比較，在結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ存在一些差異，結(jié)構(gòu)域III與大部分cry1Aa基因相同。說明來自不同國家和地區(qū)的菌株所含的同一亞類基因保守性較強(qiáng)。同時(shí)NCBI Conserved Domain Summary分析結(jié)果表明該蛋白的Domain I由N端第36～254位，共219氨基酸組成，Domain II由第259～460位，共202個(gè)氨基酸組成，Domain III由第470～607位，共138個(gè)氨基酸組成。因此，Cry1Aa蛋白的活性區(qū)估計(jì)在N-端的36～607個(gè)氨基酸附近。因此菌株LS-R-21中含有的Cry1Aa蛋白具有進(jìn)一步研究和開發(fā)的價(jià)值。

2.5 cry1Aa19基因在E.coli Rosetta(DE3)中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEB-cry1Aa轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta（DE3）中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE（8%）凝膠電泳。結(jié)果表明，無論是在可溶還是在非可溶組分中cry1Aa19基因都能通過表達(dá)載體pEB在大腸桿菌中高效表達(dá)蛋白，而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)入Rosetta（DE3）的pEB空載體沒有特異的目的條帶產(chǎn)生（見圖5）。

圖5 cry1Aa19在Rosetta(DE3)中表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析Fig.5 Protein SDS-PAGE which cry1Aa19 expressed in Rosetta(DE3)

2.6 殺蟲生物活性測定

Cry1Aa19 對小菜蛾的 LC50為 1.18 μg·mL-1，95%置信區(qū)間為0.97～1.42。陽性對照Cry1Ac對小菜蛾的LC50為4.92 μg·mL-1，95%置信區(qū)間為3.80～7.00。表明Cry1Aa19對小菜蛾有較強(qiáng)的殺蟲活性。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室從黑龍江省五常市拉林鎮(zhèn)附近分離到一株Bt菌株LS-R-21，通過顯微鏡下觀察到LS-R-21的晶體呈現(xiàn)大量的大小不一的菱形，經(jīng)PCR-RFLP體系對LS-R-21菌株進(jìn)行基因型的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株含有cry1Aa基因，其與已知的cry1Aa基因的相似性最高達(dá)99%。該蛋白與已公布的18種Cry1Aa蛋白的氨基酸序列多數(shù)存在差異，與Cry1Aa7差異最大，有33個(gè)氨基酸殘基不同。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為132.9964 ku，等電點(diǎn)為4.805，為弱酸性蛋白質(zhì)。由氨基酸組成推導(dǎo)出Cry1Aa的二級結(jié)構(gòu)表明，螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角及其他松散結(jié)構(gòu)所占比例分別為25.7%、11.6%、36.10%和26.56%。cry1Aa19與其他cry1Aa基因比較，在結(jié)構(gòu)域Ⅰ、結(jié)構(gòu)域Ⅱ中存在一些差異，結(jié)構(gòu)域Ⅲ與大部分cry1Aa基因相同。說明來自不同國家和地區(qū)的菌株所含的同一亞類基因保守性較強(qiáng)。

cry1Aa19基因在大腸桿菌中成功的表達(dá)了132 ku的重組蛋白。Cry1Aa蛋白對重要的農(nóng)業(yè)害蟲小菜蛾有較高的毒力，LC50為 1.18 μg·mL-1，95%置信區(qū)間為0.97～1.42。

本研究發(fā)現(xiàn)的cry1Aa19為我國抗蟲轉(zhuǎn)基因作物和工程菌的研制提供了新的基因來源。自轉(zhuǎn)Bt基因作物產(chǎn)業(yè)化以來，其高效的殺蟲性能和高度的特異性對其靶標(biāo)害蟲具有強(qiáng)大的選擇壓力，害蟲Bt抗性的產(chǎn)生可能對這項(xiàng)高效無公害技術(shù)的長期效益構(gòu)成威脅[14]。為延緩抗性的產(chǎn)生，分離出新的作用機(jī)制不同的殺蟲蛋白是保持轉(zhuǎn)基因作物成功的關(guān)鍵。因而開發(fā)cry1Ac類以外的基因受到人們的普遍關(guān)注。cry1Aa19基因的克隆和殺蟲活性研究，將為害蟲防治提供新的基因選擇和研究思路。為篩選、延緩和克服昆蟲產(chǎn)生抗性的基因組合提供了重要依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

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