HA混合生物玻璃制備TCP陶瓷支架及其性能的研究

鄭 衛(wèi)

(溫嶺工業(yè)園區(qū)管委會，溫嶺 317500)

引言

在過去的十年里，骨組織工程學(xué)已經(jīng)成功作為處理骨修復(fù)的一種重要方法[1]。磷酸鈣陶瓷與骨骼成分相似且具有優(yōu)良的生物特性，包括生物兼容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性，被作為骨骼修復(fù)的重要材料而廣泛應(yīng)用[2]。但是羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的力學(xué)性能制約了其在骨修復(fù)中的應(yīng)用[3-4]。有資料表示，在陶瓷支架中加入少量纖維，或者混合其他生物材料能增加原來陶瓷的力學(xué)性能[5]，因此人們開始嘗試在HA里面加入生物玻璃來提高HA的力學(xué)性能[6]。實驗結(jié)果表明，生物玻璃能大大提高HA的力學(xué)性能，因為其能在燒結(jié)過程中液化修補多孔支架裂痕[7]。同時，當生物玻璃的量為2.5～5%時(質(zhì)量比)，在一定溫度下燒結(jié)，HA支架中會有磷酸三鈣(tricalcium phosphate，TCP)出現(xiàn)[8-9]，而燒結(jié)溫度和生物玻璃的量正是控制HA轉(zhuǎn)化成TCP的關(guān)鍵因素。Nezahat等人[3]在文獻中指出當HA加入5%生物玻璃時，在燒結(jié)過程中會有很多相位變換，而TCP就是其中之一。磷酸三鈣以其良好的生物活性與生物可降解性，在骨組織工程學(xué)中的應(yīng)用逐漸得到重視。但TCP制作較HA復(fù)雜，因此筆者以HA與生物玻璃為原材料制作TCP支架，不但減少TCP制作的繁冗工序，而且以此方法制得的TCP支架的力學(xué)性能將遠遠超過以粉末制得的TCP支架。而生物玻璃與羥基磷石灰的混合比以及灼燒陶瓷的溫度是制作TCP支架的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

1 材料和方法

1.1 材料

采用塑料制作8 cm×8.5 cm×8.5 cm陶瓷支架的犧牲支架，塑料支架的熔點為105℃[10]。支架中每根管的直徑為1 mm，兩管間的空隙設(shè)計為1.5 mm(圖 1)。

圖1 大管支架3D成型圖Fig.1 3 D macro-tube scaffold

在生物玻璃與HA混合溶液中，加入一定量的聚乙烯醇(PVA)和磷酸三乙酯(TEP)，最后加入少量水使之成為粘稠狀，并攪拌1 h使混合物均勻混合。將塑料支架放入蠟溶液中，接著放入 HA/Bioglass混合物中等充分浸透并干燥后，在1400℃下灼燒3 h而制得 TCP生物陶瓷支架，其中PVC、TEP、塑料支架都會在高溫下分解。表1是為了研究不同含量的混合物(生物玻璃/HA)在不同溫度下燒結(jié)所得的支架的成分。實驗中所用試劑為Sigma公司產(chǎn)品。

表1 不同生物玻璃的含量在不同溫度下燒結(jié)Tab.1 Different sintering temperature and the bioglass additions

1.2 支架的表征

1.2.1 支架的孔率

孔隙率的計算可用以下公式[11]：體積密度(ρB)=樣品的質(zhì)量除以樣品的體積;TCP理論密度(ρ0)=2.7 g/cm3;相對密度 =(ρB/ρ0) ×100%;孔隙率=100%-相對密度。

1.2.2 支架的收縮率

支架的收縮率可以用以下公式計算：支架收縮率=(O-F)/O;其中O為原來支架的長度;F為燒結(jié)后支架的長度。

1.2.3 微量分析

X射線衍射(X-ray diffraction，XRD)用于鑒定陶瓷支架的結(jié)晶相。電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)用于觀察支架的顯微結(jié)構(gòu)、微孔分布以及細胞生長。能譜儀(energy dispersive spectroscopy，EDS)用于分析支架表面生成新物質(zhì)的化學(xué)成分。

1.2.4 力學(xué)性能測試

耐壓強度是模型測力的一個最主要參數(shù)。測力儀器為 Hounsfield Testing Machine(Model：H10K/M527，UK)，而之前被切碎用于觀察的模型不能再用。將橡膠墊置于模型兩端使其均勻受力，測力器以0.5 mm/min速率壓下。

1.2.5 模擬體液分析

模擬體液(simulated body fluid，SBF)的制備是根據(jù)Kokubo的文獻[12]。表2為模擬體液中各微量元素的含量與真正血液中微量元素的含量。

表2 SBF與血液中各微量離子的含量Tab.2 Ion concentrations of SBF and human blood plasma

支架將會被浸泡在37℃的模擬體液中21 d，每隔7 d更換新的SBF。樣品的質(zhì)量與SBF的體積比(mg/ml)為3∶5。21 d之后，將樣品拿出 SBF，在室溫下用去離子水清洗，最后進行SEM觀察。

1.2.6 生物實驗

將支架切碎，取小塊(約1 mm3)浸入細胞培養(yǎng)基里(dulbecco's modified eagle medium DMEM)，每個培養(yǎng)基內(nèi)有約1×105個骨髓干細胞，在37℃，5%CO2下存放一個星期。7 d后，經(jīng)過一系列的處理，最后用超臨界點烘干機烘干后進入電鏡觀察階段。MTT實驗是為了觀察細胞的增殖情況，實驗中分成兩組，一組的培養(yǎng)基里細胞和支架同時存在;作為比較，另外一組的培養(yǎng)基里只有細胞。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架成分確定與顯微結(jié)構(gòu)

從表3中可以看到，將20%的生物玻璃加入HA中，經(jīng)過1400℃的灼燒，能獲得TCP陶瓷支架。當溫度沒有達到1400℃或者生物玻璃與HA的成分比不夠的時候，HA在生成TCP的同時，也轉(zhuǎn)化生成了其他磷酸鈣鹽。

在燒結(jié)過程中，不同相的產(chǎn)生是根據(jù)溫度和時間的變化。當溫度在850～1200℃時，HA會經(jīng)歷以下的變化[14-15]：

表3 X衍射分析，當HA加入不等量生物玻璃后在不同溫度燒結(jié)后下支架的成分Tab.3 XRD phase analysis data for composites of HA with the addition of 10，15，and 20wt%bioglass

當溫度上升到1400℃時形成的磷酸鈣鹽會進一步生成Ca3(PO4)2(TCP)，但是大多數(shù)都是α相，而當支架降溫的時候α-TCP會變成β-TCP。同時有資料顯示，由于彈性應(yīng)變α相也會保留在相變過程中[16]。因此，最后得到的TCP支架同時含有 α-TCP與β-TCP，這可以用X射線衍射分析證明(圖2)。

圖2 TCP的衍射分析圖。(a)用此方法制得TCP衍射分析(大部分為β-TCP);(b)β-TCP粉末在燒結(jié)前(下)后(上)的衍射分析[13]Fig.2 Comparison of XRD patterns.(a)XRD pattern for a sintered porous calcium phosphate(mainly β-TCP)sample;(b)XRD patterns of β-TCP starting powder and sintered body[13]

在圖3中可以看到，支架上還有一些不規(guī)則的裂痕和小孔?？桩a(chǎn)生的原因有4點：(1)難以確定支架內(nèi)部是否灌實;(2)蠟的升華;(3)陶瓷晶粒的局部團聚;(4)根據(jù)化學(xué)反應(yīng)式(1)和式(2)，HA分解有少量水蒸氣產(chǎn)生。

裂紋的出現(xiàn)是由于陶瓷晶體的團聚產(chǎn)生，加上ABS塑料在高溫下膨脹。蠟的預(yù)涂層是為了給ABS塑料的膨脹提供空間，只是預(yù)防措施，而不能避免其膨脹，所以在燒結(jié)過程中，ABS塑料的膨脹，其力會作用在陶瓷上。同時，在高溫下陶瓷會出現(xiàn)收縮現(xiàn)象，兩作用力下產(chǎn)生裂紋。

圖3 多孔大管支架電鏡觀察Fig.3 Overview of the macro-tube TCP scaffold

3.2 支架的收縮率與孔隙率

燒結(jié)后支架的孔隙率大約為63%，大管是主要造成孔隙率較高的原因。支架的收縮率為28%，其原因在于混合陶瓷會在800℃開始形變收縮，從800℃到1150℃的之間的形變率超過25%，在1150℃后陶瓷基本不發(fā)生變化，而隨著溫度的上升，陶瓷晶粒的增大會引起支架小幅變化。一般情況下，孔隙率的提高會影響支架的力學(xué)性能，直接用TCP粉為原料，同樣的成形和升溫條件下制備多孔TCP塊體，在孔隙率相近的情況下，其抗壓強度比較本實驗方法制備的塊體低。生物玻璃在燒結(jié)過程中起了重要的作用，首先，作為反應(yīng)物與HA反應(yīng)生成TCP，使晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，晶粒重排，使產(chǎn)物強度提高。

圖4 以HA/生物玻璃制得TCP的微觀結(jié)構(gòu)。(a)800倍;(b)1600倍Fig.4 SEM micrograph of a fracture surface of the porous TCP showing the presence of micro-pores.(a)800×;(b)1600×

其次從圖4可以觀察到以HA/生物玻璃為原材料所制備的TCP多孔支架，表面的孔相對以TCP粉末制得的支架的孔(見圖5)較少，其原因是生物玻璃在700℃開始融化，隨著溫度升高生物玻璃液相附在支架表面，填補了部分空隙，使晶體粘接在一起，在燒結(jié)后以 TCP晶體附在支架表面，增強了支架的機械強度。

圖5 以TCP粉末制得的TCP微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 TCP microstructure，depicting pore size and surface area[17]

3.3 多孔支架的力學(xué)測試

圖6 支架的受力曲線圖。(a)用HA/生物玻璃制得的TCP支架;(b)用TCP粉末制得的TCP支架Fig.6 Compressive stress-strain curve.(a)Sintered HA/Bioglass made porous TCP sample;(b)Sintered TCP powder made porous TCP sample

圖6(a)是用HA與生物玻璃混合制得的多孔TCP支架受力曲線，圖中可以看到，支架最大可承受的壓強為9.98 Mpa;圖6(b)為直接用TCP粉末制得支架曲線，此曲線是多孔結(jié)構(gòu)中典型的脆性破壞曲線，其受壓強度為2.96 MPa。表4為正常人體骨骼的骨密質(zhì)與骨松質(zhì)的各項參數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)用本實驗方法制得的TCP支架雖然沒有達到骨密質(zhì)的強度，但已經(jīng)可以作為骨松質(zhì)的替代材料，而孔隙率(63%)也已滿足骨松質(zhì)的要求。因此，此法制得的支架具有良好應(yīng)用前景。

表4 骨骼的各項基本參數(shù)Tab.4 Summary of mechanical properties and porosity of human bone

3.4 支架在模擬體液中的情況

圖7 支架在SBF溶液中浸泡21 d后實用電子顯微鏡觀察與支架表面EDS分析。(a)放大4000倍(b)支架表面EDS分析Fig.7 SEM image of the scaffold after soaking in SBF for 21 days(a)4000×;(b)EDS spectra of the surfaces of TCP

圖7a是支架在模擬體液(SBF)里浸泡了21天后的結(jié)果。在顯微鏡中可以發(fā)現(xiàn)支架表面已變得粗糙，同時可以發(fā)現(xiàn)一些小圓球在支架上生成。為了研究這些小圓球的化學(xué)成分，對支架表面又進行了能譜分析。分析后的結(jié)果見圖6(b)，從圖中可以看到，這些圓球上含有大量的 P、Ca，而且他們原子成分比大約為1.65，這個特征同樣在HA里能發(fā)現(xiàn)，因此可以證明此小球為 HA;而只有高生物活性的材料在模擬體液中才能生成 HA[25];因此可以斷定用上述辦法制得的TCP支架擁有很高的生物活性。

3.5 生物實驗

3.5.1 細胞生長觀察

將支架浸入含有骨髓干細胞的懸浮液(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)中，可以發(fā)現(xiàn)，可見部分細胞粘附在材料表面，細胞的長勢良好，形態(tài)非常正常，呈現(xiàn)了良好的生物相容性。同時也出現(xiàn)了一些圓球狀晶狀體，經(jīng)材料表面沉積物的EDS分析此為磷酸鈣鹽。它對骨的形成和生長非常有利，此現(xiàn)象也證明了材料的生物學(xué)性能良好(圖8)。

圖8 細胞在TCP支架上的生長狀況。(a)2000倍;(b)500倍Fig.8 SEM micrograph shows the attachment of the cells on TCP ceramic strut surface.(a)2000×;(b)500×

經(jīng)過分析，有兩種可能會導(dǎo)致這樣的情況發(fā)生，首先是這個溶液含有牛血清，里面含有一定的與SBF相同的離子，其次TCP支架在培養(yǎng)基中也慢慢釋放出P、Ca離子，形成了SBF溶液，支架在浸放了21 d后，表面出現(xiàn)磷酸鈣鹽晶體。為了研究此晶體的形成與細胞的關(guān)系，作為比較，將支架浸入無細胞的培養(yǎng)基內(nèi)，經(jīng)過21 d的浸泡，在沒有細胞的情況下，此晶體同樣會出現(xiàn)(圖9)。因此，磷酸鈣鹽晶體的形成與細胞的存在沒有關(guān)系。

圖9 TCP支架在培養(yǎng)基里浸泡后Fig.9 SEM micrograph showed the TCP ceramic scaffold immersed into the medium without cell

3.5.2 細胞增殖實驗

用甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞增殖抑制情況是評價材料有無毒性的一個重要手段，圖9為通過9 d的培養(yǎng)細胞的增殖情況，在陰性對照組中，培養(yǎng)基里有同樣數(shù)量的細胞，在同樣的環(huán)境條件生長。在圖中可以看到通過9 d的培養(yǎng)，兩組細胞都有明顯的增長，但是在前6 d有TCP組的增長速率明顯快于對照組，而6 d后細胞增長速率大致相同。因此，用上述辦法制得的TCP不但沒有毒性，而且展示了良好的生物相容性。

圖10 細胞增殖實驗結(jié)果，誤差線為平均值±標準偏差，n=3Fig.10 MTT assay for proliferation of hBMSCs and hBMSCs combined with TCP scaffolds at different incubation periods under the same culture condition.Error bars represent mean±SD for n=3

4 結(jié)論

較之用TCP粉末直接制得的TCP支架，以HA與生物玻璃為原材料制得的TCP陶瓷支架不僅具有良好的力學(xué)性能，更接近正常骨骼所需要的強度，而且該支架材料能促進細胞增殖，觀察細胞長勢良好，表現(xiàn)出良好的生物相容性，用HA和生物玻璃來制作TCD支架是將來骨修復(fù)的一個重要研究方向。

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