H1和H3亞型禽流感病毒二重PCR 檢測(cè)方法的建立

郭 捷，謝芝勛，彭 宜，劉加波，謝志勤，龐耀珊，鄧顯文，謝麗基

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530004；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒屬中不同亞型病毒引起的禽類(lèi)感染和疾病的總稱(chēng)。禽流感病毒（AIV）為單股負(fù)鏈RNA病毒，由8個(gè)獨(dú)立的RNA節(jié)段組成，根據(jù)其表面血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的抗原性差異，可分為16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型。其中H1和H3亞型AIV雖然屬于低致病性AIV，在禽類(lèi)中沒(méi)有表現(xiàn)出明顯癥狀，較少出現(xiàn)死亡，但在人類(lèi)流感中H1和H3亞型流感病毒引起過(guò)世界性的大流行［2］，20世紀(jì)全球發(fā)生過(guò)3次流感大流行都是由H1亞型或H3亞型流感病毒造成的，尚且不能證明這幾次大流行流感的2種亞型病毒來(lái)自于禽類(lèi)，但可以推斷禽源H1和H3亞型AIV為人類(lèi)流感病毒提供了基因片段，從而間接的威脅著人類(lèi)的身體健康，具有重要的公共衛(wèi)生意義［3-7］。所以，建立同時(shí)快速檢測(cè)H1和H3亞型AIV的方法，對(duì)這兩種亞型禽流感病毒感染的診斷和控制非常關(guān)鍵。

目前對(duì)H1和H3亞型AIV感染的鑒別診斷主要依靠傳統(tǒng)的病原分離鑒定與血清學(xué)試驗(yàn)，這些方法有一定的局限性，不能同時(shí)檢測(cè)出這兩種亞型AIV。因此，本研究選擇一種具有敏感性高、特異性好、快速、簡(jiǎn)便的PCR檢測(cè)方法用于鑒別診斷H1和H3亞型禽流感病毒感染。相對(duì)于單項(xiàng)PCR技術(shù)，二重PCR技術(shù)能同時(shí)檢測(cè)并鑒別出兩種病原體，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。此方法已被廣泛應(yīng)用于一些病原微生物的檢測(cè)中，并且具有良好的敏感性和特異性［8-12］。本試驗(yàn)的目的在于建立一次PCR反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)和鑒別H1和H3兩種亞型禽流感病毒的二重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 H1、H3、H6、H9亞型AIV由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定；H5N2、H7N2亞型AIV RNA由美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)禽病診斷研究室惠贈(zèng)；新城疫病毒（NDV）F48、傳染性支氣管炎病毒（IBV）M41、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）北京株及雞毒支原體（MG）86由廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol LS Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DU 800紫外分光光度計(jì)為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已發(fā)表的H1亞型和H3亞型AIV-HA基因的保守核苷酸序列，應(yīng)用DNA Star軟件和Primer 5.0生物軟件設(shè)計(jì)針對(duì)H1亞型和H3亞型AIV基因序列的2對(duì)特異性引物，其中H1亞型AIV擴(kuò)增302bp，H3亞型AIV為626bp，引物核酸序列見(jiàn)表1。引物由Invitrogen公司合成，儲(chǔ)存液濃度為50pmol／μL，置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄 參照Trizol LS Reagent使用說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)［10］進(jìn)行病毒RNA抽提，向抽提后的RNA中加入35μL DEPC水和1.5 μL反轉(zhuǎn)錄引物：70℃10min，冰浴5min；加入反轉(zhuǎn)錄體系：10μL 5×M-Mulv buffer、2μL dNTP、0.5 μL RNA酶抑制劑、1μL AMV，瞬時(shí)離心，42℃經(jīng)90min。制備的cDNA置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 H1和H3引物的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of H1and H3primers

1.2.3 二重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化 總反應(yīng)體積為25μL，其中2×PCR Master Mix 12.5μL，H1亞型AIV cDNA和H3亞型AIV cDNA共2μL作為混合模板，引物 H1-F、H1-R各加入0.4μL，H3-F、H3-R各加入0.6μL，最后用雙蒸水補(bǔ)至25μL。對(duì)二重PCR的各引物濃度及PCR反應(yīng)的各參數(shù)（溫度、時(shí)間）進(jìn)行優(yōu)化，以篩選出二重PCR反應(yīng)體系中最佳的反應(yīng)模式。

1.2.4 二重PCR的特異性試驗(yàn) 利用本研究?jī)?yōu)化好的二重PCR反應(yīng)體系，同時(shí)擴(kuò)增H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型 AIV、NDV、IBV、ILTV 及 MG的核苷酸進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)其特異性。

1.2.5 二重PCR的敏感性試驗(yàn) 將制備好的H1 AIV和H3AIV RNA按10倍倍比稀釋?zhuān)肂eckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定稀釋后各個(gè)梯度的RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄后采用最佳引物濃度和二重PCR反應(yīng)模式，分別對(duì)上述模板進(jìn)行二重PCR擴(kuò)增以檢測(cè)其敏感性。

1.2.6 臨床樣品檢測(cè) 應(yīng)用所建立的PCR方法，對(duì)17份從廣西南寧市活禽市場(chǎng)采集的口腔和糞便拭子進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 二重PCR條件的優(yōu)化

通過(guò)對(duì)H1亞型AIV、H3亞型AIV 2種引物濃度的測(cè)定及二重PCR擴(kuò)增的溫度、時(shí)間等的優(yōu)化，最后確定二重PCR最佳反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 12.5μL，H1亞型AIV上下引物（50 pmol／μL）各0.1μL，H3亞型 AIV 上下引物（50 pmol／μL）各0.4μL，混合模板2μL，加水至25μL。二重PCR的最佳反應(yīng)模式為：94℃4min；94℃50 s，56℃50s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。其PCR反應(yīng)產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果并拍照。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，含有H1亞型AIV、H3亞型AIV的核酸樣品均能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的302bp和626bp 2個(gè)明亮條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）；而其他亞型流感病毒和禽呼吸道疾病病原均未擴(kuò)增出任何條帶，說(shuō)明該方法有較好的特異性。

圖1 二重PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Specificity results of duplex PCR

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)得H1亞型AIV和H3亞型AIV總RNA濃度分別為500 ng／μL、260ng／μL，應(yīng)用優(yōu)化后的二重PCR方法對(duì)10倍梯度稀釋的H1亞型AIV、H3亞型AIV核酸模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，該二重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到50pg的H1亞型AIV和26pg的H3亞型AIV核酸模板（圖2）。

圖2 二重PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Sensitivity results of duplex PCR

2.4 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

在廣西南寧市17份活禽市場(chǎng)樣品中，抽提RNA反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行二重PCR檢測(cè)，結(jié)果有4份為H1亞型AIV陽(yáng)性，5份為H3亞型AIV陽(yáng)性（圖3），與病毒分離鑒定的結(jié)果一致。

3 討論

AIV 16種HA亞型中，H1亞型和H3亞型屬于低致病性禽流感病毒，但在人類(lèi)流感病毒中，自1997年起，H1N1型與H3N2型在人群中交替流行，嚴(yán)重影響了人類(lèi)的身體健康［13-15］，其中的基因片段有可能來(lái)自于禽流感的H1和H3亞型。因此，本研究針對(duì)H1亞型AIV-HA基因和H3亞型AIV-HA基因，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，使該P(yáng)CR反應(yīng)能同時(shí)擴(kuò)增出針對(duì)H1亞型和H3亞型AIV的目的片段，對(duì)我國(guó)現(xiàn)有H1亞型和H3亞型AIV的檢測(cè)有十分重要的意義。

圖3 二重PCR檢測(cè)臨床樣品的結(jié)果Fig.3 The detection results of clinical samples by duplex PCR

因?yàn)楦腥綡1和H3亞型禽流感病毒的禽類(lèi)不會(huì)表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，也很難通過(guò)病理組織變化觀察進(jìn)行鑒定。另外，傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)方法敏感性不高。本研究所建立的二重PCR，對(duì)含有H1亞型AIV毒株、H3亞型AIV毒株進(jìn)行了二重PCR檢測(cè)，結(jié)果均同時(shí)得到了與試驗(yàn)設(shè)計(jì)大小相符的擴(kuò)增條帶，而對(duì)其他對(duì)照病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說(shuō)明本試驗(yàn)所建立的二重PCR特異性良好。同時(shí)，利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度大小的不同直接判定擴(kuò)增結(jié)果，使得該方法在結(jié)果判定上更加直觀、簡(jiǎn)便。另外，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該二重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到50pg H1亞型AIV模板，26pg H3亞型AIV模板，可以看出該二重PCR方法敏感性較高。通過(guò)臨床檢測(cè)，也體現(xiàn)出來(lái)該二重PCR方法的高度準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性。

綜上所述，本研究所建立的二重PCR方法，對(duì)同時(shí)鑒別檢測(cè)H1亞型AIV和H3亞型AIV具有簡(jiǎn)便快速、特異性好、靈敏度高等特點(diǎn)，為H1和H3亞型禽流感的診斷和監(jiān)控提供了技術(shù)手段。

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