秦谷雨，楊 勇，李 郁，魏建忠，孫 裴，＊

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.安徽安泰農(nóng)業(yè)集團(tuán)，安徽合肥230036）

豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudotabie，PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus-2，PCV-2）的單獨(dú)或混合感染是引起仔豬病毒性腹瀉的重要病因［1-3］。各種年齡的豬均對(duì)這5種病毒易感，尤其是哺乳仔豬感染率與病死率都很高［4-5］。2010年冬季以來(lái)，新生仔豬病毒性腹瀉在我國(guó)乃至東南亞多個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率的流行態(tài)勢(shì)，死亡仔豬超過(guò)100萬(wàn)頭，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8-9］。目前，我國(guó)南方數(shù)省（廣西、廣東、福建、甘肅等?。?duì)其病因的研究表明，病原主要是PEDV的變異株，與韓國(guó)2011年流行株的同源性最高［5-7］。但是不同地區(qū)有其相應(yīng)區(qū)域性，尚未有研究在安徽省地區(qū)造成仔豬病毒性腹瀉的病因。本試驗(yàn)旨在探索出安徽省致使仔豬腹瀉流行的病毒性病因，為制定適宜安徽省防控仔豬腹瀉的措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2011年10月～2012年5月，從安徽地區(qū)37個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集腹瀉仔豬的糞便或病死豬腸段共計(jì)186份（表1），仔豬日齡范圍為1日齡～60日齡，其中1日齡～10日齡仔豬120例，11日齡～15日齡仔豬35例，30日齡～60日齡仔豬31例；病料在-80℃保存。PEDV、TGEV、PDV陽(yáng)性病料由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何啟蓋教授惠贈(zèng)，PRV和PCV-2陽(yáng)性毒株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定與保存。

1.1.2 主要試劑 RNAsimple Total RNA kit為OMEGA公司產(chǎn)品；Quant One Step RT-PCR Kit為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；RNA反轉(zhuǎn)錄酶、RNA 酶抑制劑、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL 2000、DNA Marker DL 600等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)［2，11］以及根據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的PEDV、TGEV、PDV、PRV、和PCV-2核酸序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。P1／P2為PEDV檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段大小為213bp；P3／P4為T(mén)GEV檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段大小為546bp；P5／P6為PDV檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段大小為309bp；P7／P8為PRV檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段大小為217bp；P9／P10為PRV-2檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段大小為630bp（表2）。1.2.2 病料處理 按照文獻(xiàn)［12］，取2cm～3cm的腸段或5g仔豬腹瀉糞便，用滅菌的玻璃勻漿器進(jìn)行研磨，用pH7.4的Hanks液做10倍稀釋，反復(fù)凍融2次～3次，3 000r／min離心10min；取上清液；4℃、12 000r／min離心5min；收集上清液于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 187份病料來(lái)源Table 1 Sources of collected 187diseased materials

表2 5種病毒PCR及RT-PCR特異性檢測(cè)引物序列及擴(kuò)增片段大小Table 2 Sequences and sizes of used for PCR（RT-PCR）amplification of 5kinds of viruses

1.2.3 DNA的提取及PRV／PCV-2的檢測(cè) 取250μL上述病料上清液加400μL消化液，55℃水浴，消化4h～5h；12 000r／min離心10min；取400 μL上清液，加200μL Tris飽和酚，200μL氯仿，翻轉(zhuǎn)均勻，12 000r／min離心10min，取上清400μL，加800μL冰凍乙醇，置-20℃沉淀30min，12 000 r／min離心5min，4℃，棄液，再加500μL 700 mL／L乙醇洗滌，棄去干燥，加ddH2O 30μL～50 μL溶解，置-20℃保存?zhèn)溆?。PRV的PCR擴(kuò)增條件為：PCR反應(yīng)體系為25μL，含有Gc-mix 12.5μL（TaqE＋dNTP），去離子水5.5μL，上引物 P5 1μL，下引物P6 1μL，DNA模板5μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃1min，65℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃7min。設(shè)PRV細(xì)胞毒作為陽(yáng)性對(duì)照，PRV陰性病料作為陰性對(duì)照。PCV-2的PCR擴(kuò)增條件為：根據(jù)參考文獻(xiàn)［13-14］進(jìn)行PCR操作，PCR反應(yīng)體系為25μL，其中DNA模板（1pmol／μL）5μL，Mix（TaqE＋dNTP）13μL，去離子水5μL，上引物P9 1μL，下引物P10 1μL；PCR反應(yīng)條件為：95℃10min；95℃1min，72℃40s，49℃50s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。設(shè)PCV-2細(xì)胞毒作為陽(yáng)性對(duì)照，PCV-2陰性病料作為陰性對(duì)照。1.2.4 RNA的提取及PEDV、TGEV和PDV的檢測(cè) 按照RNA Simple Total RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病料總RNA。按照Quant One Step RTPCR Kit說(shuō)明書(shū)，分別進(jìn)行PEDV、TGEV和PDV的檢測(cè)。Quant One Step RT-PCR反應(yīng)體系與操作方法為：反應(yīng)總體系50μL，冰上操作，預(yù)加入30.5μL的Quant One Step RT-PCR反應(yīng)混合液，再加入1μg～10ng總RNA模版，分別加上、下游引物（濃度為10μmol／L）各3μL，補(bǔ) RNase-free ddH2O至50μL。根據(jù)參考文獻(xiàn)［11-12］，PEDV、TGEV的PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；PDV的PCR反應(yīng)條件為：94℃4min；94℃45s，50℃45 s，72℃ 45s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。設(shè) PEDV、TGEV和PDV細(xì)胞毒作為陽(yáng)性對(duì)照，未接毒細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

瓊脂糖凝膠電泳顯示，5種病毒陽(yáng)性病料PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期片段大小一致，如PEDV陽(yáng)性病料擴(kuò)增到大小為213bp的片段；TGEV陽(yáng)性病料擴(kuò)增到大小為546bp的片段；PDV陽(yáng)性病料擴(kuò)增到大小為309bp的片段；PRV陽(yáng)性病料擴(kuò)增到大小為217bp的片段；PRV-2陽(yáng)性病料擴(kuò)增到大小為630bp片段。5種病毒陰性對(duì)照均未擴(kuò)增到目的片段（圖1）。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物能作為相應(yīng)病毒的檢測(cè)。

圖1 5種病毒PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR results of five viruses

2.2 病料中5種病原檢測(cè)結(jié)果

對(duì)186份病料進(jìn)行5種病原PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性病料數(shù)為110例（占59.1%），陽(yáng)性豬場(chǎng)28個(gè)（占75.7%）；TGEV陽(yáng)性病料數(shù)為10例（占5.4%），陽(yáng)性豬場(chǎng)3個(gè)（占8.1%）；RV陽(yáng)性病料數(shù)為5例（占2.7%），陽(yáng)性豬場(chǎng)1個(gè)（占2.7%）；PRV陽(yáng)性病料數(shù)為15例（占8.1%），陽(yáng)性豬場(chǎng)8個(gè)（占21.6%）；PCV-2陽(yáng)性病料數(shù)為48例（占25.8%），陽(yáng)性豬場(chǎng)20個(gè)（占54.1%）。

PEDV與TGEV混合感染陽(yáng)性病料數(shù)為8例（占4.3%），PEDV與PCV-2混合感染陽(yáng)性病料數(shù)為35例（占18.8%），PEDV與PRV混合感染陽(yáng)性病料數(shù)為20例（占10.8%），PRV和PCV-2陽(yáng)性病料數(shù)為9例（占4.8%），其他病因50例（占26.9%）。

安徽地區(qū)2011年10月～2012年5月期間37個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)仔豬病毒性腹瀉病原中，PEDV感染率最高，陽(yáng)性率可達(dá)59.1%，是導(dǎo)致仔豬腹瀉的主要病因；其次PCV-2和或PRV單一感染和或PEDV的混合感染，也是造成該地區(qū)仔豬腹瀉的重 要原因。

圖2 5種病毒單一或混合感染率Fig.2 Single or mixed infection rates of five viruses

3 討論

2011年何啟蓋［15］報(bào)道了華中地區(qū)57個(gè)豬場(chǎng)的855份樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，其中33個(gè)豬場(chǎng)為PEDV感染，陽(yáng)性場(chǎng)占58%，PCV-2陽(yáng)性場(chǎng)占46%，RV陽(yáng)性場(chǎng)占22%，TGEV陽(yáng)性場(chǎng)占14%。本研究結(jié)果顯示，PEDV陽(yáng)性豬場(chǎng)占75.7%，PCV-2陽(yáng)性豬場(chǎng)占54.1%，PEDV與PCV-2混合感染陽(yáng)性占18.8%、PEDV與PRV混合感染陽(yáng)性數(shù)占10.8%，結(jié)果表明安徽地區(qū)PEDV的感染是近2年仔豬腹瀉的重要傳染性病因。PCV-2、PRV和或PEDV單一或混合感染也是豬群腹瀉的重要病因。

比較已有報(bào)道［1，8，10，12］，本研究結(jié)果提示，安徽省豬流行性腹瀉的流行病學(xué)發(fā)生了新特點(diǎn)：①流行范圍廣，幾乎遍布了安徽省各個(gè)地區(qū)。②免疫接種豬仍發(fā)病。本文受檢37個(gè)豬場(chǎng)中有50%以上每年9月份免疫減毒或滅活腹瀉三聯(lián)苗（PEDV＋TGEV＋RV）或二聯(lián)苗（PEDV＋TGEV），然而腹瀉疫情仍有發(fā)生。③季節(jié)性變得不明顯。不僅在冬季流行情況嚴(yán)重，時(shí)間上也一直蔓延到了今年的春末（4月和5月份仍有發(fā)生）。有報(bào)道［16］其他省區(qū)夏季高溫時(shí)期仍有出現(xiàn)流行性腹瀉。④高發(fā)于哺乳仔豬。187份病料中，1日齡～10日齡仔豬120例，11日齡～15日齡仔豬35例，30日齡～60日齡仔豬31例，哺乳仔豬發(fā)病數(shù)占82.9%，癥狀也最嚴(yán)重?；疾∽胸i表現(xiàn)水樣腹瀉，或伴隨嘔吐，嘔吐多發(fā)生于吃食或吮乳之后。糞便如水，呈灰黃色或灰色［17-18］。仔豬消瘦，皮膚呈油膩狀，常于腹瀉后2d～4d內(nèi)因脫水而死亡，病死率最高達(dá)100%。

綜合研究結(jié)果，PEDV、PCV-2、PRV的單純或混合性感染是近年安徽省仔豬腹瀉的最為重要的三大病毒性疾病，結(jié)果提示在今后的豬腹瀉病防控過(guò)程中應(yīng)該著重加強(qiáng)該3種疾病的綜合防控，同時(shí)本研究所設(shè)計(jì)的5種病原PCR引物也為該5種病原的快速診斷提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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