表皮生長因子在滎經(jīng)長毛兔腸道中的表達特征

郭紅瑞，何 敏，吳 雪

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川雅安625014）

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）于1959年由美國生物學(xué)家Cohen S［1］首次從小鼠頜下腺中提取，并于1962年被提純。經(jīng)研究證明，EGF是一種由53個氨基酸殘基組成的單鏈多肽類活性物質(zhì)，因具有促進表皮增厚及角質(zhì)化而得名，是動物體內(nèi)重要的生長因子之一，其具有廣泛的生物學(xué)活性［2-3］。EGF可以參與細胞內(nèi)的DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及細胞外大分子的生物合成等過程。EGF通過與細胞膜上的EGF受體（EGFR）結(jié)合，從而誘導(dǎo)受體自身磷酸化，激活受體酪氨酸蛋白激酶活性，催化多種底物蛋白酪氨酸殘基（Tyr）磷酸化，啟動、催化、維持與細胞生長增殖有關(guān)的一系列生化過程［4］。在胃腸道內(nèi)，表皮生長因子（EGF）能參與保持胃腸道黏膜的完整和通過刺激多種細胞的分裂增殖修復(fù)胃腸道黏膜［5］，這些細胞主要是表皮細胞和內(nèi)皮細胞。目前，大量相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究表明EGF與胃腸道疾病有密切關(guān)系。

滎經(jīng)長毛兔（Yingjing Angora rabbit）屬于兔形目兔科，是2005年通過四川省畜禽品種委員會審定命名的中型細毛型長毛兔新品系，由四川省滎經(jīng)縣畜牧局、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、雅安市畜牧局聯(lián)合培育而成，其遺傳性能、產(chǎn)毛性能穩(wěn)定，繁殖能力較強［6］。此外，兔子也是一種醫(yī)學(xué)方面常用的實驗動物。目前越來越多的學(xué)者將注意力集中到EGF對動物胃腸道黏膜保護作用及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收方面［7-8］，但對EGF在健康動物腸道各部位的分布和形態(tài)研究較少。鑒于此，本研究對健康狀況下滎經(jīng)長毛兔腸道各部位EGF表達水平進行檢測，旨在為滎經(jīng)長毛兔胃腸道的研究積累資料，同時對滎經(jīng)長毛兔以及其他兔類腸道疾病的治療提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物 4月齡～8月齡健康滎經(jīng)長毛兔共12只，雌雄各半，體重（2.5±0.5）kg，均購自四川省雅安市滎經(jīng)縣長毛兔養(yǎng)殖場。

1.1.2 試劑 濃縮型兔抗人EGF多克隆抗體（產(chǎn)品編號：BA0250），DAB（產(chǎn)品編號：AR1022），SABC試劑盒（產(chǎn)品編號：SA1022）均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 樣本采取 滎經(jīng)長毛兔進行頸動脈放血處死，迅速取出十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸，每段組織0.5cm左右，以Bouin氏液固定保存。

1.2.2 組織制片和染色 固定好的組織按常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，用LEICA RM 2135型石蠟切片機切片，厚5μm。切片貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，60℃烘烤2h，脫蠟復(fù)水后，以30mL／L H2O25min～10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗凈后，用0.01mol／L枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復(fù)（中火10min～15min），滴加50mL／L BSA封閉液，室溫孵化20min，PBS洗，加入一抗（1∶100）4℃過夜，PBS洗，生物素化二抗37℃中孵化20min，PBS洗，SABC 37℃中孵化20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。每個部位進行抗體反應(yīng)時均以相鄰切片作為對照片，對照組以PBS替代一抗，其余步驟同上。

1.2.3 顯微攝像、圖像分析及數(shù)據(jù)處理 將制得的切片在顯微鏡下觀察、記錄。用NIS-Elements F 3.2成像軟件對每個部位隨機取18個高倍（40×10）視野。對圖像用形態(tài)學(xué)分析軟件測定每個視野EGF的平均光密度值。對所得的數(shù)據(jù)用SPSS1 6.0軟件進行顯著性分析。結(jié)果用平均值±標準差（±sD）表示。

2 結(jié)果

在免疫組化染色的切片中，EGF陽性產(chǎn)物呈黃色和棕黃色，底色呈淺藍色，反差明顯易辨認。陰性對照呈陰性。

2.1 EGF在滎經(jīng)長毛兔腸道組織的分布特征

在滎經(jīng)長毛兔腸道各部位都有EGF的分布，但在各個部位的分布特點有一定差異。EGF主要分布在十二指腸固有層細胞胞質(zhì)中。在空腸，EGF主要分布在固有層細胞胞質(zhì)中。此外，在少量腸黏膜上皮細胞胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)EGF分布，在腸腺上皮細胞胞質(zhì)中間也有發(fā)現(xiàn)，但極少。

EGF在回腸中主要分布在固有層細胞的胞質(zhì)中。在黏膜上皮細胞細胞的胞質(zhì)中有少量的EGF分布。回腸中黏膜上皮細胞中EGF的分布量比在空腸中分布的要多。在黏膜下層細胞胞質(zhì)中也有一定量的EGF分布，偶爾可見有EGF分布在腸腺上皮細胞的胞質(zhì)中。

盲腸、結(jié)腸、直腸中EGF的分布位置基本相同，主要分布在固有層細胞的胞質(zhì)中。在黏膜上皮細胞的胞質(zhì)中也有EGF分布，其分布量和空腸相近。

圖1 EGF在滎經(jīng)長毛兔腸道的分布Fig.1 Distribution of epidermal growth factor（EGF）in intestine of Yingjing Angora rabbit

在腸道各段之間EGF陽性細胞的形態(tài)略有差異，在固有層中細胞主要以圓形和不規(guī)則形為主，也有錐形、橢圓形和梭形，在腸黏膜上皮分布的EGF細胞形態(tài)主要是橢圓形和梭形，在腸腺上皮分布的EGF細胞都是圓形。

2.2 EGF陽性細胞在各部位平均光密度值及其比較

EGF在腸道各部位平均光密度值存在一定的差異其中盲腸的平均光密度值最大，其次為結(jié)腸、空腸、直腸、十二指腸、回腸。在整個腸道的EGF的分布起伏不大，只有在盲腸和結(jié)腸的分布出現(xiàn)升高，在其余部位無顯著差異。對各個部位EGF平均光密度值用SPSS軟件進行顯著性分析，各部位的平均光密度值進行Duncan多重比較后的結(jié)果如表1所示，其中盲腸部位所測的平均光密度值最高（P＜0.01），其次是結(jié)腸（P＜0.05），在十二指腸、空腸和直腸差異不顯著。

表1 腸道各部位EGF的平均光密度值Table 1 The average optical density of EGF in intestinal tract

3 討論

3.1 EGF在滎經(jīng)長毛兔腸道的分布形態(tài)特點

已有學(xué)者［9］研究認為EGF的分泌方式有：①自分泌：細胞產(chǎn)生EGF的同時產(chǎn)生EGFR，作用于自身細胞。涉及損傷的愈合，腫瘤和胚胎的發(fā)生。②旁分泌：細胞產(chǎn)生的EGF作用于另一種EGFR的細胞。如胃黏膜干細胞產(chǎn)生EGF作用于附近的黏膜細胞。③內(nèi)分泌：EGF經(jīng)過管道作用于一定距離的細胞。如腮腺分泌的EGF作用于口腔黏膜上皮。而在對人腸道［10］EGF的研究中認為腸絨毛上皮細胞、固有層細胞、內(nèi)皮細胞和漿膜上皮細胞都能夠合成并分泌EGF蛋白，而且還能表達其受體，表明內(nèi)源性EGF通過自分泌和旁分泌方式與受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用。而有研究認為腸道的腸絨毛上皮細胞、隱窩上皮細胞等許多細胞的細胞膜表面有EGFR存在［11］，所以在腸道的EGF可以通過多種方式分泌與EGFR結(jié)合。目前對EGF所在細胞的形態(tài)研究較少，在對滎經(jīng)長毛兔腸道EGF所在細胞的形態(tài)進行觀察，可以發(fā)現(xiàn)有EGF分布的腸黏膜上皮細胞的形態(tài)主要是橢圓形和梭形，其突起指向腸腔和腸固有層，固有層中EGF細胞的形態(tài)為錐形或梭形，其突起指向旁邊的細胞，并且可看到有EGF蛋白顆粒從突起分泌出，從形態(tài)學(xué)上可以推斷這種細胞可以將EGF分泌到另一種細胞，與該細胞的EGFR結(jié)合而發(fā)揮作用，EGF的旁分泌功能。固有層內(nèi)EGF細胞的形態(tài)主要是圓形，該圓形的細胞可能是產(chǎn)生EGF然后作用于自身，自身細胞存在EGFR并與其結(jié)合發(fā)揮作用，從而發(fā)揮EGF自分泌功能。因此本研究結(jié)果提示，在滎經(jīng)長毛兔腸道的內(nèi)源性EGF通過自分泌和旁分泌的方式與細胞膜上的EGFR結(jié)合發(fā)揮保護腸黏膜作用。至于在腸道的EGF是否有內(nèi)分泌功能還不能確定，有待進一步深入研究。

3.2 EGF在滎經(jīng)長毛兔腸道的分布特點

家兔為草食動物，其腸道特別長。腸道包括大腸和小腸，小腸有十二指腸、空腸、回腸，空腸為最長的一段，回腸腸壁上血管較少，回腸和盲腸相接處有一圓小囊為兔特有。大腸有盲腸、結(jié)腸、直腸，所有家畜中兔的盲腸比例最大，在盲腸壁上有兩塊明顯的淋巴組織稱為盲腸扁桃體結(jié)構(gòu)和圓小囊相似，盲腸的游離端為蚓突，其結(jié)構(gòu)也與盲腸扁桃體相似，含豐富的淋巴組織［12］。滎經(jīng)長毛兔的腸道結(jié)構(gòu)與其他兔類相比無明顯差異。在腸道的消化作用方面，草食動物的大腸特別發(fā)達，食糜在大腸停留的時間很長，大腸在整個消化過程中占非常重要的地位，是機體能量的主要來源之一，大腸中的微生物作用促進飼料中纖維素、糖的分解吸收［13］。

腸黏膜在受到一定程度的損傷刺激后可啟動修復(fù)機制，使腸黏膜迅速恢復(fù)完整性，這是腸道抵抗疾病的重要屏障能力［14］。本試驗檢測到EGF在滎經(jīng)長毛兔消化道各段中均呈陽性反應(yīng)，因此內(nèi)源性EGF可能在腸道的損傷愈合過程中起重要作用，同時這一細胞因子可能是消化道上皮修復(fù)和再生的重要內(nèi)源性調(diào)控因子。對滎經(jīng)長毛兔腸道各部分的EGF分布的平均光密度值進行測定，在盲腸的光密度值最高，結(jié)腸其次。盲腸和結(jié)腸的平均光密度值與小腸有顯著性差異。這表明在盲腸、結(jié)腸陽性反應(yīng)比較強，EGF在這些部位分布較多。在盲腸陽性較強的原因可能是由于其特殊的結(jié)構(gòu)和生理作用。從盲腸的生理作用可知兔子盲腸中有許多的細菌和微生物增加其動力，在小腸消化后的食糜進而運送到盲腸經(jīng)行微生物發(fā)酵［15］。EGF對腸道有保護作用，有研究表明［16-17］EGF具有抑制細菌移位，通過抑制細菌在腸黏膜上的定植來實現(xiàn)對腸道的保護。通過上述資料推測可能是因為盲腸中細菌微生物太多對腸道組織可能有破壞作用，需要分布多量的EGF對腸道起保護作用。同時EGF又有影響營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運功能［18］，或許在盲腸、結(jié)腸分布的多與其是消化吸收的重要器官有關(guān)。對于EGF在盲腸、結(jié)腸的作用機制還需進一步進行研究證明。在小腸EGF陽性細胞沒有盲腸和結(jié)腸那么多可能是由于病害等刺激因素較少，而小腸的自身消化吸收能力較強，小腸中菌群較少，所以小腸組織中不需要太多的EGF分布。至于具體是什么原因還需進一步探究。

從目前眾多學(xué)者對EGF的研究中表明，EGF是一種非常重要的多肽類生長因子，在維持動物腸道健康發(fā)揮著非常重要的作用。而在不同的動物腸道的分布位置有細小的區(qū)別，在對大鼠［19］和人［10］的腸道EGF的研究結(jié)果中顯示，在大鼠小腸中EGF主要分布在小腸黏膜上皮細胞、固有層細胞和黏膜基層細胞胞漿中，表達強度為強陽性，在人的腸道中EGF主要分布在小腸黏膜上皮細胞、黏膜下層的血管內(nèi)皮細胞和漿膜上皮細胞的胞漿和胞外基質(zhì)中。在滎經(jīng)長毛兔腸道中EGF主要分布在固有層細胞、腸黏膜上皮細胞胞質(zhì)中，有極少數(shù)分布在腸腺上皮細胞胞質(zhì)中。EGF分布的部位可能與其所起的作用有關(guān)，在觀察的結(jié)果中EGF主要分布在各腸道的腸固有層細胞的胞質(zhì)中，而固有層中含有腸腺、血管、淋巴管、神經(jīng)等，還含有各種功能的結(jié)締組織細胞，EGF可以通過自分泌和旁分泌的方式與EGFR結(jié)合發(fā)揮作用，EGF可提高小腸黏膜刷狀緣水解酶及胰腺消化酶的活性，加強小腸和胰腺的分泌功能，加快細胞的分化和增殖，從而加快初生動物腸道的成熟，調(diào)節(jié)消化腺的分泌，刺激黏膜增生，影響營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運等［20］，同時還可以防止E.coli等病菌侵入動物機體，并改善其受損腸道的消化機能［21］，以預(yù)防腸道潰瘍的發(fā)生，促進潰瘍的愈合［22］。在陷窩中腸腺之間的固有層中也有EGF分布，而小腸黏膜上皮細胞來源于腸隱窩底部的干細胞［23］，所以認為EGF具有誘導(dǎo)陷窩干細胞激活，快速增殖，從而修復(fù)腸道結(jié)構(gòu)的作用［10］。此外，在腸絨毛上皮細胞的胞質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)有EGF的分布，并且在腸黏膜上皮細胞基部有梭形的EGF陽性細胞，其突起指向腸黏膜上皮細胞，推測可能是EGF陽性細胞分泌出EGF與腸黏膜上皮細胞的EGFR結(jié)合發(fā)揮作用來刺激腸道黏液的分泌，保護黏膜的機械屏障和化學(xué)屏障來減少細菌在腸黏膜上定植和移位［16-17］，還能潤滑食物減少粗糙食物對腸道的機械刺激［24］?？傊?，EGF對腸道各部分都有一定的保護和促進作用，對腸道具有重要意義。

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