PEG 介導(dǎo)細(xì)胞融合最適條件的探討

王 惠，郭 峰，關(guān) 超，張 梅，關(guān) 萍＊，白洪志

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽110866；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，遼寧沈陽110866）

細(xì)胞融合（cell fusion），又稱細(xì)胞雜交，是指在外力的作用下2個或2個以上的細(xì)胞融合成一個雙核或多核細(xì)胞的現(xiàn)象，因此又稱細(xì)胞雜交。細(xì)胞融合技術(shù)是研究細(xì)胞遺傳、基因定位、細(xì)胞免疫、病毒、腫瘤和培育生物新品種的重要手段［1-3］，尤其是近年來發(fā)展起來的新研究技術(shù)有著更為重大的實(shí)踐意義［4-7］。細(xì)胞融合的方法包括仙臺病毒誘導(dǎo)法、物理融合技術(shù)（電融合技術(shù)）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）法等。其中PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設(shè)備、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，被普遍用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域［8-9］。但 該 方 法 也 受 許 多 因 素 的 影 響［10-15］，如PEG濃度、融合溫度、融合時間等。

本試驗(yàn)選取雞紅細(xì)胞、兔紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞作為同源與異源細(xì)胞研究的試驗(yàn)材料，從PEG濃度、融合溫度、融合時間三個方面進(jìn)行單因素探索，以期找到融合率最高時的條件，達(dá)到更好的融合效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 不同濃度的PEG（Mr=4 000）：250、500、750mL／L PEG；380g／L檸檬酸鈉；8.5g／L生理鹽水；GKN液；Hanks液；750mL／L酒精。

1.1.2 儀器 電子天平，恒溫水浴鍋，低速離心機(jī)，微量移液槍，光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度PEG的配制 稱取少許PEG（Mr=4 000）放入小燒杯中，沸水浴加熱，使其熔化，分別移取等量的3份至刻度試管中，待冷至50℃時，分別加入預(yù)熱的3倍體積、1倍體積、1／3體積的GKN液，混勻，配成250、500、750mL／L的PEG。

1.2.2 紅細(xì)胞的采取及細(xì)胞懸液的制備 用滅菌的注射器吸入38g／L的檸檬酸鈉2mL，從用750 mL／L酒精消過毒的雞翼靜脈處（兔是從耳緣靜脈處，蟾蜍是從主動脈弓處）采取靜脈血轉(zhuǎn)入事先裝有38g／L的檸檬酸鈉的燒杯中使檸檬酸鈉與血液的體積比為1∶4，放入4℃冰箱中保存。

取懸液1mL移入10mL的刻度離心管內(nèi)，加入8.5g／L生理鹽水4mL混勻，1 500r／min離心5 min；棄上清液（用吸管吸去），加8.5g／L生理鹽水至5mL，混勻后1 500r／min再離心5min；重復(fù)上述操作，再離心洗滌1次；收集最后一次離心沉淀的紅細(xì)胞，用手指輕彈底壁使沉淀松散［9］。用微量移液器移取細(xì)胞沉淀至干凈試管中，加入9倍體積的GKN液，配成100mL／L的細(xì)胞懸液。

1.2.3 細(xì)胞融合的方法 試驗(yàn)分6組進(jìn)行，同源3組，異源3組，分別為雞-雞、兔-兔、蟾蜍-蟾蜍、雞-兔、雞-蟾蜍和兔-蟾蜍的紅細(xì)胞融合，每組10只試管進(jìn)行單因素試驗(yàn)，篩選出每組融合的最佳條件。

1.2.3.1 PEG濃度對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 分別取紅細(xì)胞懸液200μL（同源組取200μL，異源組則分別取異源的兩種紅細(xì)胞各100 μL）至3個刻度離心管中，分別加入預(yù)熱的100μL的250、500、750mL／L的PEG，放于37℃水浴鍋內(nèi)溫浴5min后，再分別加入Hank＇s液5mL，靜置2 min以終止PEG的作用；用微量移液器移取少量紅細(xì)胞懸液至血球計數(shù)板上，蓋上蓋玻片，觀察紅細(xì)胞融合情況。

1.2.3.2 融合時間對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 分別取紅細(xì)胞懸液200μL（同1.2.3.1）至3個刻度離心管中，分別加入預(yù)熱的100μL上一項試驗(yàn)中融合率最高時的PEG，放于37℃水浴鍋內(nèi)溫浴5、10、15min后，再分別加入 Hank＇s液5 mL，終止PEG的作用，觀察紅細(xì)胞融合情況。

1.2.3.3 融合溫度對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 分別取紅細(xì)胞懸液200μL（同1.2.3.1）至3個刻度離心管中，分別加入預(yù)熱的100μL上一項試驗(yàn)中融合率最高時的PEG，分別放于23℃、30℃、37℃、44℃水浴鍋內(nèi)溫浴上一項試驗(yàn)中測得的融合率最高時的融合時間，再分別加入Hank＇s液5 mL，終止PEG的作用，觀察紅細(xì)胞融合情況。

1.2.4 細(xì)胞融合率的計算 在顯微鏡視野里，每個視野下讀取計數(shù)板中間大方格中四角中方格及中心中方格中融合的細(xì)胞及未融合的細(xì)胞數(shù)（注意區(qū)分融合細(xì)胞與重疊細(xì)胞［16］），用下面的公式計算每方格內(nèi)的融合率，取平均值。

融合率=融合的細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%［17］

2 結(jié)果

2.1 PEG介導(dǎo)的紅細(xì)胞融合的最適條件探索

2.1.1 PEG濃度對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探索 在37℃、5min融合時間處理條件下，各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時，PEG為250mL／L的融合率最低，PEG為750mL／L的融合率次之，PEG為500mL／L的融合率最高，其中，同源紅細(xì)胞融合中，以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為37.8%，異源紅細(xì)胞融合中，以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為11.1%（表1）。

表1 不同濃度PEG同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 1 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different PEG concentrations %

2.1.2 融合時間對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 在PEG 500mL／L、37℃處理條件下，各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時，融合時間5min的融合率最低，10min的融合率次之，15min的融合率最高（蟾蜍例外，在10min融合率最高）。其中，同源紅細(xì)胞融合時，以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為38.2%，異源紅細(xì)胞融合中，以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為12.7%（表2）。

表2 不同融合時間同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 2 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different response time %

2.1.3 融合溫度對同源、異源紅細(xì)胞融合最適條件的探究 在融合時間15min、PEG 500mL／L條件下，各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時，融合溫度23℃的融合率最低，30℃的融合率次之，37℃的融合率最高，溫度升高至44℃時，融合率反而下降。其中，同源紅細(xì)胞融合時，以兔同源紅細(xì)胞融合率最高為39.3%，異源紅細(xì)胞融合時，以兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率最高為14.0%（表3）。

2.2 條件分析

2.2.1 PEG濃度對紅細(xì)胞融合效果的影響 根據(jù)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理可知，PEG是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。在不同濃度PEG溶液中，由于PEG-水之間的氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致兩個細(xì)胞接觸點(diǎn)的質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組和疏散，由于兩細(xì)胞接口處質(zhì)膜的雙分子層之間的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而促使細(xì)胞發(fā)生融合，理論上，所用PEG濃度越高，細(xì)胞融合效果應(yīng)該越好。由表1試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，PEG為500 mL／L時，紅細(xì)胞融合率最高，而PEG為750mL／L對細(xì)胞的毒性過大，試驗(yàn)過程也顯示PEG為750 mL／L時質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生大的變化，出現(xiàn)部分細(xì)胞破碎。

表3 不同融合溫度同源、異源紅細(xì)胞融合率Table 3 Cell fusion rates of isogenous，heterogenous erythrocytes in different reaction temperature %

2.2.2 融合時間對紅細(xì)胞融合效果的影響 由表2可知，蟾蜍同源紅細(xì)胞融合組的最適融合時間是10min，其余組均為15min，但仔細(xì)分析數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，每組10min與15min時的融合率差距并不是很大。因此，可知融合時間對雞紅細(xì)胞的融合率影響不很明顯，融合率不隨時間的推移發(fā)生顯著變化，這是由于PEG誘導(dǎo)細(xì)胞的膜間發(fā)生接觸、黏連，使細(xì)胞開始融合，經(jīng)離心去除PEG后，黏連的細(xì)胞便隨融合的進(jìn)程自然進(jìn)行所致。

2.2.3 融合溫度對紅細(xì)胞融合效果的影響 由表3可知，各種類型同源、異源紅細(xì)胞融合時，均表現(xiàn)隨著溫度的升高，融合率逐漸增高，在37℃時融合率達(dá)到最大，此后隨著溫度繼續(xù)升高，融合率開始下降。理論研究可知，在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞脂雙層膜會隨著溫度的升高而流動性增強(qiáng)。流動性的增強(qiáng)也有益于細(xì)胞間細(xì)胞膜的融合，提高融合率，但過高溫度也會使細(xì)胞因承受不了高溫而失去活性，引起融合率降低。尤其是當(dāng)融合的細(xì)胞是蟾蜍類的冷血動物時，其紅細(xì)胞對溫度更為敏感。

2.3 融合率的差異性分析

2.3.1 同源組融合率的差異性分析 同源紅細(xì)胞融合時，雞同源紅細(xì)胞在PEG為500mL／L、37℃、15min條件下，融合率7.0%；兔同源紅細(xì)胞在PEG為500mL／L、37℃、15min條件下，融合率39.3%；蟾蜍同源紅細(xì)胞在PEG為500mL／L、37℃、10min條件下，融合率10.8%。都是最適條件，但融合率差距較大。從幾何學(xué)的角度分析可以知道，兔紅細(xì)胞呈球形，可以減少運(yùn)動時的阻力，因此球形細(xì)胞比橢球形運(yùn)動速度快，與其他細(xì)胞接觸機(jī)會大大增高，導(dǎo)致融合率比橢球形的雞紅細(xì)胞、蟾蜍紅細(xì)胞都高。且在相同細(xì)胞密度下，細(xì)胞體積越大，細(xì)胞間碰觸的機(jī)會也高，這也是雖外觀都為橢球形，但蟾蜍紅細(xì)胞融合率高于雞紅細(xì)胞的原因。

2.3.2 異源組融合率的差異性分析 異源紅細(xì)胞融合時，在最適條件下，雞-兔異源紅細(xì)胞融合率為10.4%，雞-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率為6.2%，兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合率為14.0%。雞-兔異源紅細(xì)胞、兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合效果都略高于雞、蟾蜍同源時的融合效果，其原因均可歸結(jié)為兔紅細(xì)胞具有球形外觀，其本身的運(yùn)動性高于其他兩種細(xì)胞，因此使得異源細(xì)胞間的接觸機(jī)會高于雞與蟾蜍同源接觸機(jī)會，且在兔-蟾蜍異源紅細(xì)胞融合時，視野下可看到由于兔與蟾蜍紅細(xì)胞體積差距5倍左右，一個蟾蜍紅細(xì)胞可同時與多個兔紅細(xì)胞接觸并進(jìn)一步融合，使融合率有所提升。但整體可看出異源細(xì)胞間的融合率明顯低于同源間，分析原因，可能由于不同物種間的差異性造成的。

綜上，從單因素試驗(yàn)及結(jié)果分析中可以看出，除蟾蜍同源紅細(xì)胞融合組的最適融合條件為PEG為500mL／L、37℃、10min反應(yīng)時間，其余組，無論是恒溫動物還是變溫動物紅細(xì)胞，其細(xì)胞融合的最適條件均為PEG 500mL／L、37℃、15min反應(yīng)時間。但從融合率上可見兔紅細(xì)胞同源融合率遠(yuǎn)高于其他各組，而整體上同源組的融合率高于異源組。

3 討論

本試驗(yàn)采用雞、兔、蟾蜍紅細(xì)胞為原材料取材既簡單方便又新鮮可行，且一次性采血量較大，可滿足大量學(xué)生使用，成本不會增加。就融合條件而言，PEG最適濃度為500mL／L，這是由于PEG濃度過高時，其細(xì)胞反應(yīng)液體環(huán)境黏滯度過高，可能會阻礙細(xì)胞融合。最適溫度37℃，高于30℃，這是因?yàn)殡S著溫度升高，細(xì)胞膜的流動性增強(qiáng)，有益于融合，而過高溫度也會使細(xì)胞因承受不了高溫而失去活性，引起融合率降低。而10min與15min反應(yīng)時間的融合率差距并不是很大，對紅細(xì)胞的融合率影響不太明顯，融合率不隨時間的推移發(fā)生顯著變化，這是由于PEG誘導(dǎo)細(xì)胞的膜間發(fā)生接觸、黏連，使細(xì)胞開始融合，經(jīng)離心去除PEG后，黏連的細(xì)胞便隨融合的進(jìn)程自然進(jìn)行所致。

PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設(shè)備、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，被普遍用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領(lǐng)域。因此，對PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合的最適條件探究顯得尤為必要。相信隨著研究的不斷深入，細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣［18］，產(chǎn)生的影響也日益顯著。

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