周興軍，董愛華，董向鋒，宋 欣，李立敏

(1.華北制藥集團 新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，2.抗體藥物研制國家重點實驗室，3.微生物藥物國家工程研究中心，河北 石家莊 050015)

乙型肝炎(乙肝)是危害人類健康的世界性問題。乙肝除爆發(fā)性肝炎外主要危害在于感染后變?yōu)槁圆《緮y帶者，并進一步發(fā)展成為慢性肝炎，對此類患者目前尚缺乏有效的治療方法，故常導(dǎo)致患者病情遷延不愈、部分患者發(fā)展為肝硬化甚至肝癌［1］。接種乙肝疫苗是預(yù)防和控制乙肝傳播的重要措施。乙肝易感者接受乙肝抗原HBsAg刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答，出現(xiàn)保護性抗體抗-HBs，從而獲得對乙肝病毒HBV感染的免疫保護能力，起到主動免疫預(yù)防效果。但是，在接種乙肝疫苗的人群中，存在10%左右的無或低應(yīng)答者，可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)疾病或其他慢性疾病、年齡、肥胖、煙酒史以及疫苗因素等有關(guān)［2］。因此，研制新型配伍的乙肝疫苗以加強目前的免疫效果尤為必要。

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Gm-csf)是一個具有多項潛能的骨髓造血生長因子，不僅能夠促進造血前體細胞的增殖、分化和成熟，而且可以通過多種機制激活機體的T細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［3］。本文探討了Gm-csf對三種不同來源乙肝疫苗免疫原性和免疫效果的影響。

1 材料

重組(CHO 細胞)乙肝疫苗(10 μg:1.0 mL，批號:A20050211)、注射用重組 Gm-csf(rhGm-csf，300 μg/支，批號:20050631)，華北制藥集團金坦生物技術(shù)股份有限公司;重組(漢遜酵母)乙肝疫苗(10 μg∶0.5 mL，批號:2005030306)，大連漢信生物制藥有限公司;重組(酵母)乙肝疫苗(1.0 mL/支，批號:2005010104)，北京天壇生物制品股份公司。

乙肝病毒表面抗體酶聯(lián)免疫法診斷試劑盒，北京萬泰生物藥業(yè)有限公司。

BALB/c小鼠，SPF級，雌性，體重16～18 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證編號:SCXK(京)2002-0003。

2 方法

將BALB/c小鼠，隨機分為3組，每組10只。CHO細胞疫苗組:皮下給予CHO細胞表達乙肝疫苗 1 μg/只，同時給予 rhGm-csf 10 μg/只;漢遜酵母疫苗組:皮下給予漢遜酵母表達的乙肝疫苗1 μg/只，同時給予rhGm-csf 10 μg/只;啤酒酵母疫苗組:皮下給予啤酒酵母表達的乙肝疫苗1 μg/只，同時給予rhGm-csf 10 μg/只。分別于初次免疫后，每周眼眶采血約 200 μL，3 000 r/min 離心 15 min，分離血清，檢測血清中抗-HBsAg抗體滴度。

3 結(jié)果

初次免疫后1周，CHO細胞疫苗組的10只小鼠，有9只血清中抗-HBsAg抗體呈陽性，1只為陰性，陽性率為90%;漢遜酵母疫苗組的10只小鼠，僅有1只血清中抗-HBsAg抗體呈陽性，9只為陰性，陽性率為10%;啤酒酵母疫苗組的10只小鼠，血清中抗-HBsAg抗體均不呈陽性，10只均為陰性，陽性率為0;經(jīng)卡方檢驗，CHO細胞疫苗組與漢遜酵母疫苗組、啤酒酵母疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.01)。

初次免疫后2周，CHO細胞疫苗組的10只小鼠，有10只血清中抗-HBsAg抗體呈陽性，陽性率為100%;漢遜酵母疫苗組的10只小鼠，有4只血清中抗-HBsAg抗體呈陽性，6只為陰性，陽性率為40%;啤酒酵母疫苗組的10只小鼠，有4只血清中抗-HB-sAg抗體呈陽性，6只為陰性，陽性率為40%;經(jīng)卡方檢驗，CHO細胞疫苗組與漢遜酵母疫苗組、啤酒酵母疫苗組相比有顯著性差異(P＜0.01)。

二次免疫后，三組小鼠血清中抗體持續(xù)增加，第12周CHO細胞疫苗組達到峰值(221 986±278 247)miu/mL，分別為漢遜酵母疫苗組［(101 219±243 351)miu/mL］和啤酒酵母疫苗組［(90 555±130 912)miu/mL］的2.2倍和2.5倍。

4 討論

本研究表明，在rhGm-csf的免疫調(diào)節(jié)作用下，不同來源的乙肝疫苗在抗體產(chǎn)生快慢和抗體滴度等方面存在差異，重組(CHO細胞)乙肝疫苗可以快速出現(xiàn)保護性抗體抗-HBs，而且抗體滴度較高，遠遠高于漢遜酵母和啤酒酵母表達的乙肝疫苗，這可能與CHO細胞表達的乙肝表面抗原更接近自然表面抗原是其能產(chǎn)生更好的免疫原性的主要原因［4］。Gm-csf可以明顯提高乙肝疫苗的免疫原性，能增強機體體液免疫的效果。特別是在機體的免疫細胞被Gm-csf激活的同時，接受到乙肝疫苗的抗原刺激，會誘發(fā)更加迅速、有效的抗原提呈，并且在多種細胞因子的協(xié)同作用下，有效的誘發(fā)B細胞分化、成熟為抗體分泌型B細胞和記憶型B細胞，使機體對HBV形成了持久有效的免疫保護［5］。

因此，Gm-csf和CHO細胞表達的乙肝疫苗配伍，對于改善對現(xiàn)有乙肝疫苗反應(yīng)低下或無反應(yīng)的人群的免疫狀況，有效遏制乙肝流行狀態(tài)，降低由乙肝引發(fā)的肝硬化和肝癌的死亡，具有很大潛力。

［1］ 莊 輝.乙型肝炎疫苗免疫［J］.中華肝病雜志雜志，2003，4:197.

［2］ 梁爭論，李河民.接種乙型肝炎疫苗無/低應(yīng)答與HLA關(guān)聯(lián)的研究進展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進展，2004，32(4):54-57.

［3］ 趙忠信.重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的臨床新用途［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2007，7(1):71-73.

［4］ 高 潔，韓慶英，馬淑花.不同劑量和種類基因工程乙型肝炎疫苗免疫效果研究［J］.中國計劃免疫，2000，6(3):135-137.

［5］ 周興軍，王世聰.粒細胞巨噬細胞集落刺激因子與乙型肝炎疫苗協(xié)同誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答［J］.中國生化藥物雜志，2007，28(3):179-181.