唐 利 王鴻度 陳 莊 (瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型形態(tài)學(xué)與計(jì)量學(xué)研究及其應(yīng)用

唐 利 王鴻度1陳 莊 (瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

骨質(zhì)疏松;形態(tài)學(xué);計(jì)量學(xué)

骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變(松質(zhì)骨骨小梁變細(xì)、數(shù)量減少、斷裂;皮質(zhì)骨多孔、變薄)為特征，以致骨脆性增加、骨折危險(xiǎn)性增高的全身代謝性骨病〔1〕。隨著人均壽命延長(zhǎng)、老齡化社會(huì)的到來(lái)及骨質(zhì)疏松并發(fā)癥發(fā)病率的上升，研制各種防治新藥、探尋多種治療手段及其作用機(jī)制以改善患者生活質(zhì)量變得越來(lái)越重要，如何準(zhǔn)確檢測(cè)與評(píng)價(jià)各種治療后骨組織的發(fā)展動(dòng)態(tài)又顯得尤為重要，在眾多檢測(cè)與評(píng)價(jià)方法中，形態(tài)學(xué)與計(jì)量學(xué)方法對(duì)骨質(zhì)疏松的防治研究有著極其重要的價(jià)值和意義。

1 骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型

由于骨質(zhì)疏松為慢性病，而骨活檢為有創(chuàng)性，存在一定痛苦，難以被患者接受，故直接對(duì)人體骨組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)與計(jì)量學(xué)研究存在一定困難，動(dòng)物模型作為一種替代手段有著極其重要的作用。用于骨質(zhì)疏松的模型動(dòng)物有大鼠、小鼠、犬、兔、豬、羊、狒狒、猴等〔2〕，選擇時(shí)以能最大程度復(fù)制人骨質(zhì)疏松特點(diǎn)、重復(fù)性好、便于操作且經(jīng)濟(jì)有效為標(biāo)準(zhǔn)，目前大鼠應(yīng)用最多。造模方法有去勢(shì)法、制動(dòng)失用法、糖皮質(zhì)激素及維甲酸灌胃誘導(dǎo)法等〔3，4〕，其中在1969年由Savile建立的去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型，經(jīng)反復(fù)證實(shí)，被公認(rèn)為復(fù)制骨質(zhì)疏松的“經(jīng)典病理模型”。選擇骨骼與性接近成熟的6月齡大鼠去勢(shì)后造模較適合，也有人認(rèn)為選擇6～9月齡大鼠也能達(dá)到理想的復(fù)制效果〔5〕。

2 骨質(zhì)疏松形態(tài)學(xué)研究及其應(yīng)用

2.1 標(biāo)本的制備 處死動(dòng)物前第11、12天和第2、3天需分別皮下注射鹽酸四環(huán)素和鈣黃綠素(Calcein)行熒光雙標(biāo)記，以利于骨動(dòng)態(tài)參數(shù)的測(cè)量〔6〕。

骨質(zhì)疏松主要發(fā)生在松質(zhì)骨，如長(zhǎng)骨干骺端和椎骨，以脛骨為例，取左、右脛骨近端1/3，分別沿縱、橫切面鋸開后固定脫水。由于常規(guī)脫鈣會(huì)使骨組織丟失約2/3左右的鈣鹽，組織形態(tài)嚴(yán)重形變，不能準(zhǔn)確評(píng)估骨的真實(shí)情況：骨小梁結(jié)構(gòu)遭到破壞，難于進(jìn)行形態(tài)學(xué)計(jì)量，導(dǎo)致骨生長(zhǎng)與鈣化方面的信息丟失;骨細(xì)胞表面抗原受損丟失嚴(yán)重，不利于進(jìn)行免疫組化檢測(cè)〔7，8〕。采用李朵等〔8〕對(duì)Erben甲基丙烯酸甲酯(MMA)低溫塑料包埋法(簡(jiǎn)稱舊法)改良后的不脫鈣包埋新法，不僅簡(jiǎn)化了包埋，且克服了上述難題。包埋后用硬組織切片機(jī)切成約8 μm的厚骨片(測(cè)量松質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù))和5μm的薄骨片(測(cè)量松質(zhì)骨靜態(tài)參數(shù))〔6〕。厚骨片直接透明封片后熒光顯微鏡下觀察，測(cè)量單、雙標(biāo)記熒光線長(zhǎng)、寬等。薄骨片則可根據(jù)想要了解的不同骨細(xì)胞的情況和骨組織的某些結(jié)構(gòu)選取不同的染色方法：①M(fèi)asson-Goldner Trichrome染色〔9〕，骨小梁中骨細(xì)胞胞漿紅染;骨小梁綠色，其邊緣未礦化類骨質(zhì)紅染，二者界清;破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞胞漿橘黃色，胞核灰藍(lán)等。該染色法為觀察骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)和測(cè)量其周長(zhǎng)骨小梁圖像分析的最佳方法〔10〕。②甲苯胺藍(lán)染色常用于測(cè)量骨小梁厚度及寬度、骨壁厚等。③奧新藍(lán)染色使小梁骨鈣化軟骨軸呈紫紅色，通過(guò)測(cè)量分析其周長(zhǎng)、面積及光密度等，可大致明確其成熟度〔11〕。④Dahl-McGee-Russell茜素紅S和Von Kossa染色，可清晰顯示組織內(nèi)鈣鹽，前者顯示鈣化點(diǎn)及鈣化局部，后者顯示鈣鹽沉著量〔10〕。⑤Giemsa法和亞甲基藍(lán)一堿性品紅更適用于觀察成骨細(xì)胞，Goldner'S三色法用于區(qū)分骨礦化的不同階段及顯示成骨更具優(yōu)勢(shì)〔12〕。⑥苦味酸天狼猩紅染色偏振光檢測(cè)法〔13〕可對(duì)骨膠原進(jìn)行分析測(cè)定及分型。

2.2 免疫組化及原位雜交 隨著骨質(zhì)疏松等骨代謝性疾病基礎(chǔ)研究地不斷深入，對(duì)其發(fā)病及治療分子機(jī)制的研究已越來(lái)越多。在分子病理學(xué)研究中，免疫組化和原位雜交技術(shù)已相當(dāng)成熟并被廣泛應(yīng)用〔9〕，不脫鈣骨組織包埋技術(shù)的不斷改進(jìn)更促進(jìn)了其在骨組織研究領(lǐng)域的應(yīng)用。研究表明〔9〕，多種細(xì)胞因子參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生，如胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等。咎強(qiáng)等〔14〕用免疫組化法對(duì)強(qiáng)骨顆粒治療骨質(zhì)疏松大鼠后骨組織中TGF-β1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其對(duì)骨代謝產(chǎn)生的影響。李劍等〔9〕、李朵等〔15〕采用免疫組化和原位雜交技術(shù)分別檢測(cè)了骨組織細(xì)胞中IGF-1、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-2)mRNA和蛋白表達(dá)。雌激素在維持骨吸收與骨形成的平衡中發(fā)揮重要作用，該觀點(diǎn)已得到證實(shí)與廣泛認(rèn)同，雌激素受體(ER)在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均存在〔16〕，通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)ER，對(duì)深入研究雌激素對(duì)骨質(zhì)疏松的影響機(jī)制有重要意義。該技術(shù)已成為檢測(cè)骨組織中多種細(xì)胞因子表達(dá)水平改變的重要手段，為骨質(zhì)疏松等代謝性骨病的分子病理學(xué)研究提供了有效技術(shù)平臺(tái)。

3 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究及其應(yīng)用

單純的骨形態(tài)學(xué)只能定性不能定量，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的發(fā)展彌補(bǔ)了這一不足。骨形態(tài)計(jì)量學(xué)是一種基于體視學(xué)原理，在硬組織切片二維圖像上推導(dǎo)出可反映骨量、骨結(jié)構(gòu)、骨重建等三維結(jié)構(gòu)的方法〔17〕。Parfitt等〔18〕對(duì)其相關(guān)術(shù)語(yǔ)、符號(hào)及單位制定了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，隨著骨計(jì)量學(xué)的發(fā)展，采用半自動(dòng)數(shù)字化圖像分析系統(tǒng)和測(cè)量軟件更便于定性、定量測(cè)量計(jì)量學(xué)參數(shù)，如骨小梁表面積、平均骨小梁厚度、骨小梁寬度、骨小梁分離度、平均類骨質(zhì)寬、平均類骨質(zhì)表面、平均類骨質(zhì)體積、破骨細(xì)胞活躍表面、成骨細(xì)胞活躍表面、平均骨壁厚等;四環(huán)素等熒光標(biāo)記物可與骨特異性結(jié)合并沉積在其礦化前沿，通過(guò)活體熒光標(biāo)記，可在骨重建過(guò)程中體現(xiàn)時(shí)間因素，從而測(cè)定多組骨動(dòng)力學(xué)參數(shù)〔19〕。測(cè)量范圍一般在距骺線近端1 mm至遠(yuǎn)端4 mm的區(qū)域內(nèi)〔20〕。

骨計(jì)量學(xué)動(dòng)態(tài)參數(shù)包括：骨吸收參數(shù)一破骨細(xì)胞周長(zhǎng)百分率(%Oc.Pm)、單位骨小梁面積上的破骨細(xì)胞數(shù)(Oc.N)等;骨形成參數(shù)一礦化沉積率(MAR)、熒光標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(L.Pm%)、單位骨小梁面積骨形成率(BFR/Bv)、單位骨小梁周長(zhǎng)骨形成率(BFR/BS)等〔21〕。靜態(tài)參數(shù)包括：反映骨結(jié)構(gòu)的參數(shù)一骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁寬度(Tb.Wi);反映骨量的參數(shù)一骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(%Tb.Ar)。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)骨質(zhì)疏松的研究多集中在松質(zhì)骨，這主要是由于皮質(zhì)骨發(fā)生骨質(zhì)疏松過(guò)于緩慢且不明顯，但皮質(zhì)骨占長(zhǎng)骨骨量的80%，不僅決定著骨的結(jié)構(gòu)和形態(tài)，對(duì)骨功能完善程度也起關(guān)鍵作用〔6〕;Vilimaki等〔21，22〕也指出，骨質(zhì)疏松發(fā)生時(shí)，除骨小梁骨量明顯減少外，皮質(zhì)骨骨量也減少，因此不應(yīng)忽視對(duì)皮質(zhì)骨的觀察。Okumura〔23〕等發(fā)現(xiàn)去勢(shì)聯(lián)合糖皮質(zhì)激素法造模能加快皮質(zhì)骨骨丟失，可見，多種方法聯(lián)合造模對(duì)皮質(zhì)骨的研究有重要意義。皮質(zhì)骨動(dòng)態(tài)參數(shù)包括皮質(zhì)骨內(nèi)膜熒光標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(%E-L.Pm)、皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨形成率(E-BFR)、皮質(zhì)骨外膜面熒光標(biāo)記周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(%P-L.Pm)、皮質(zhì)骨外膜面骨形成率(P-BFR)和皮質(zhì)骨內(nèi)膜面骨吸收周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)(%Er.Pm)。

近年來(lái)，骨計(jì)量學(xué)廣泛用于骨質(zhì)疏松等代謝性骨病發(fā)生機(jī)制、藥效學(xué)及各種防治手段的研究。Rude等〔24〕研究元素鎂對(duì)骨的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，與飼料中鎂充足的對(duì)照組相比，飼料中鎂缺乏組大鼠其單位骨小梁面積上成骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞活躍表面均增加，骨小梁面積百分?jǐn)?shù)降低，可見鎂缺乏對(duì)骨質(zhì)疏松的形成有促進(jìn)作用。梁曉萍等〔25〕在探討甲狀旁腺激素1-34(hPTH1-34)對(duì)骨質(zhì)疏松的治療作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，hPTH1-34治療后，大鼠脛骨礦化沉積率、骨小梁面積增加明顯，可見hPTH1-34對(duì)骨質(zhì)疏松有治療作用。Vahle等〔26〕觀察不同劑量重組人甲狀旁腺激素1-34(rhPTH1-34)對(duì)大鼠骨各項(xiàng)指標(biāo)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用藥劑量為75 μg/kg左右時(shí)，不同時(shí)段大鼠骨髓腔面積相對(duì)較小，皮質(zhì)骨面積、小梁骨面積和平均皮質(zhì)骨厚度相對(duì)較大，這為該藥用于臨床的有效性、安全性及最適用藥量的選擇提供了參考。李福安等〔27〕在應(yīng)用周圍神經(jīng)功能性電刺激防治大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：骨形成參數(shù)-礦化沉積率、骨形成率增加;骨吸收參數(shù)-骨吸收周長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)增加;骨結(jié)構(gòu)-骨小梁數(shù)量及厚度均減少、分離度增加;高轉(zhuǎn)化參數(shù)-激活頻率顯著增加，這為電刺激法用于防治骨質(zhì)疏松提供了佐證。骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展為一慢性過(guò)程，中藥調(diào)理對(duì)其防治有重要作用，很多學(xué)者對(duì)強(qiáng)骨顆粒、骨靈片、仙靈骨葆等中藥的療效進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)及活性、骨結(jié)構(gòu)形態(tài)與數(shù)值、骨量改變及骨轉(zhuǎn)換率等信息的分析，判斷骨重建的不同階段，為多種中藥防治骨質(zhì)疏松的有效性提供有力依據(jù)。

骨質(zhì)疏松檢測(cè)方法眾多，如骨密度、影像學(xué)、生物力學(xué)、形態(tài)學(xué)與計(jì)量學(xué)、生化等檢測(cè)，雖然骨密度檢測(cè)為目前臨床診斷、動(dòng)物模型評(píng)價(jià)、藥效評(píng)估的常用方法，但只有骨量發(fā)生明顯變化時(shí)才能反映出來(lái)，靈敏度低、重現(xiàn)性差〔28〕。有研究表明〔29〕，骨形態(tài)學(xué)變化先于骨密度、生物性能和血、尿生化等的變化，提示骨質(zhì)疏松發(fā)生過(guò)程中，形態(tài)改變可能早于性能改變。因此，觀察藥效、評(píng)估各種防治手段等須更重視形態(tài)學(xué)改變。骨形態(tài)學(xué)結(jié)合骨計(jì)量學(xué)使得形態(tài)學(xué)改變與機(jī)能定量檢測(cè)能夠準(zhǔn)確的予以揭示，再聯(lián)合骨密度等多項(xiàng)檢測(cè)，可全面了解骨病理生理改變與功能變化，為準(zhǔn)確診斷骨質(zhì)疏松、評(píng)價(jià)藥效、評(píng)估防治新手段等提供理論依據(jù)。

1 No authors listed.Consensus development conference：diagnosis，prophylaxis and treatment of osteoporosis〔J〕.Am J Med，1993;94(6)：646-50.

2 劉鈺瑜，吳 鐵，王 暉.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的研究進(jìn)展〔J〕.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2002，7(2)：570-2.

3 Jee WS，Yao W.Overview：animal models of osteopenia and osteoporosis〔J〕.J Musculoskel Neuron Interact，2001;1(3)：193-207.

4 馮秉瑋，高雨仁，楊桂嬌.維甲酸致雌性大鼠骨質(zhì)疏松的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究〔J〕. 包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004;20(4)：271-3.

5 鄭良樸，李遠(yuǎn)志，胡海霞，等.不同月齡大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型的比較〔J〕. 福建中醫(yī)藥，2009;40(2)：50-1.

6 張延?jì)?，李紹新，陳 博.哌嗪雌酚酮對(duì)生長(zhǎng)期去卵巢小鼠脛骨骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響〔J〕.廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010;28(2)：125-8.

7 張雙燕，謝幼專，薛文東，等.塑料包埋技術(shù)在骨組織研究中的應(yīng)用〔J〕.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)生物工程學(xué)雜志，2006;12(5)：430-2.

8 李 朵，魏?jiǎn)⒂?，范青松，?不脫鈣骨組織包埋技術(shù)的改進(jìn)〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2005;21(6)：731.

9 李 劍，廖二元，魏?jiǎn)⒂?，?不脫鈣骨組織免疫組織化學(xué)與原位雜交的方法研究〔J〕.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;28(6)：601-4.

10 呂 榮，王 軍，徐新智，等.塑料包埋非脫鈣骨技術(shù)在骨組織學(xué)與圖像分析中的應(yīng)用〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2006;22(3)：369.

11 李 莉，張 平，沈乾一，等.實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松大鼠脛骨髁病理變化的圖像分析研究〔J〕.中國(guó)骨傷，2003;16(12)：719-22.

12 王東勝.三種特殊染色法顯示不脫鈣骨切片中新生骨的比較研究〔J〕. 中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006;4(3)：139-40.

13 汪 青，孫 蘭，龔海洋，等.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型建立與評(píng)價(jià)〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，1999;15(5)：392-3.

14 咎 強(qiáng)，陳世柱，王勇剛.強(qiáng)骨顆粒對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清中IGF-1、TGF-β1及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)的影響〔J〕. 陜西中醫(yī)，2009;30(12)：1669-70.

15 李 朵，魏?jiǎn)⒂祝枨?，?人類不脫鈣骨組織的免疫組化與原位雜交〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2006;12(2)：159-62.

16 張曉麗.雌激素在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)和作用〔J〕.四川生理科學(xué)雜志，2010;32(3)：131.

17 劉忠厚.骨礦與臨床〔M〕.北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社，2006：353-6.

18 Parfitt AM，Drezner MK，Glorieux FH，et al.Bone Histomorphometry：Standardization of Nomenclature，Symbols，and Units〔J〕.J Bone Miner Res，1987;2(6)：595-608.

19 Vincent A，F(xiàn)itzpatrick LA.Soy isoflavone：are they useful in menopause?〔J〕.Mayo Clin Proc，2000;7(5)：1174-84.

20 劉曉青，崔 燎，吳 鐵.雙側(cè)卵巢切除大鼠不同時(shí)間段骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的觀察〔J〕.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2005;11(4)：428.

21 Vilimaki MJ，Tahtela R，Jones JD，et al.Bone resorption in healthy and osteoporotic postmenopausal women〔J〕.Eur J Endocrinol，1994;131(3)：258-67.

22 Marie PJ.The molecular genetics of bone formation：implications for therapeutic interventions in bone disorders〔J〕.Am J Pharmacogenomics，2001;1(3)：175-87.

23 Okumura H，Yamamuro T，Kasai R，et al.Effect ofα-hydroxyvitamin D3 on osteoporosis induced by immobilization combines with ovariectomy in rats〔J〕.Bone，1987;8(6)：351-5.

24 Rude RK，Gruber HE，Norton HJ，et al.Bone loss induced by dietary magnesium reduction to 10%of the nutrient requirement in rats is associated with increased release of substance P and tumor necrosis factor-α〔J〕?J Nutr，2004;134(1)：79-85.

25 梁曉萍，戴 勇，文錦麗，等.甲狀旁腺素1-34對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2005;7(25)：802-3.

26 Vahle JL，Sato M，Long GG，et al.Skeletal changes in rats given daily subcutaneous injections of recombinant human parathyroid hormone(1-34)for 2 years and relevance to human safety〔J〕.Toxicol Pathol，2002;30(3)：312-21.

27 李福安，李 全，文 寧.周圍神經(jīng)功能性電刺激防治大鼠實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松的骨形態(tài)計(jì)量學(xué)研究〔J〕.中醫(yī)正骨，2002;14(6)：3-4.

28 吳 波.骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型研究的現(xiàn)狀與展望〔J〕.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1996;31(4)：316-20.

29 趙 燁，楊亞軍，馬世平，等.去勢(shì)大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)、生物性能變化〔J〕. 北京生物醫(yī)學(xué)工程，2007;26(2)：194.

R331

A

1005-9202(2012)17-3851-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.17.130

國(guó)家中醫(yī)藥管理局科研專項(xiàng)課題(No.06-07JP40);四川省科技廳科研專項(xiàng)課題(No.2009JY0127)

1 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院

陳 莊(1954-)，男，博士后，教授，主要從事免疫病理學(xué)研究。

唐 利(1986-)，女，技師，主要從事實(shí)驗(yàn)病理學(xué)研究。

〔2011-07-19收稿 2011-11-15修回〕

(編輯 趙慧玲)