河南省職業(yè)病防治研究院 肖慶鋒 秦文華

生物材料中化學(xué)毒物快速鑒定技術(shù)研究*

河南省職業(yè)病防治研究院 肖慶鋒 秦文華

生物樣品檢測(cè)，即檢測(cè)人體內(nèi)生物材料中化學(xué)物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物的含量，常用來(lái)評(píng)價(jià)人體接觸化學(xué)物質(zhì)的程度以及可能造成的健康影響。對(duì)職業(yè)人群的生物樣品檢測(cè)，可以用來(lái)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)職業(yè)環(huán)境中有害因素的濃度。生物樣品的檢測(cè)與環(huán)境監(jiān)測(cè)相輔相成，為評(píng)價(jià)職業(yè)有害因素對(duì)人體的危害提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)的檢測(cè)，尤其是對(duì)健康效應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)，有助于發(fā)現(xiàn)和確定易感人群，篩檢不宜從事某項(xiàng)工種的人群，從而減少職業(yè)病的發(fā)生。生物樣品的檢驗(yàn)?zāi)茌^為準(zhǔn)確地測(cè)量勞動(dòng)者體內(nèi)有害物質(zhì)的含量，在職業(yè)流行病學(xué)調(diào)查和外源性化學(xué)物危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)中經(jīng)常被采用。本文，筆者利用原子吸收分光光度計(jì)、氣相色譜儀、分光光度計(jì)和電化學(xué)分析儀等儀器，結(jié)合捕集阱頂空預(yù)分離技術(shù)，系統(tǒng)研究了一些化學(xué)毒物的鑒定技術(shù)，為評(píng)價(jià)人體接觸化學(xué)毒物的程度與可能造成的健康影響提供必要的檢測(cè)手段，并且為化學(xué)中毒應(yīng)急救治提供依據(jù)。

一、生物樣品中無(wú)機(jī)化學(xué)毒物快速鑒定技術(shù)研究

1.原子熒光測(cè)定法測(cè)定尿液、血液中銻的含量。

（1）測(cè)定原理。將樣品經(jīng)濕法消解后，在酸性條件下，加入硫脲和抗壞血酸，使五價(jià)銻預(yù)還原為三價(jià)銻，再加入硼氫化鈉或硼氫化鉀使三價(jià)銻還原生成銻化氫，將氬氣載入石英原子化器中，將銻化氫中的銻分解為原子態(tài)銻。原子態(tài)銻在銻空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)下產(chǎn)生原子熒光，原子熒光發(fā)光強(qiáng)度在固定條件下與被測(cè)液中的銻濃度成正比，因此可以通過(guò)檢測(cè)原子熒光發(fā)光強(qiáng)度來(lái)計(jì)算血液中銻的濃度。

（2）測(cè)定方法。取1 mL樣品放入錐形瓶中，加入3 mL H2O2和4.5 mL HNO3（即H2O2與HNO3體積比為2∶3），放置3 h，用恒熱電熱板在100℃時(shí)加熱處理30 min，再在110℃時(shí)加熱趕酸，直至近干，冷卻后轉(zhuǎn)移至5 mL比色管中，同時(shí)加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的HCl，用質(zhì)量濃度為10 g/L的抗壞血酸-硫脲混合液定容至5 mL。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比較酸度、硼氫化鉀濃度、載氣及屏蔽氣流速等因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。樣品處理選用H2O2和HNO3的混合液作為消解試劑，所得結(jié)果精密度符合要求，且整個(gè)方法重現(xiàn)性好，取樣量少，靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，基體干擾少，測(cè)定儀器價(jià)格低，適合于職業(yè)接觸或中毒人群尿液、血液中銻的含量分析。

2.微分電位溶出分析法測(cè)定生物材料中鎵的含量。將待測(cè)樣品置于10 mL的比色管中，分別加入適量的鎵標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的KCl溶液、1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%的甲酸溶液和150 μg Hg2+，定容至5 mL，放入微分電位儀測(cè)定鎵含量。該方法不需要特殊試劑，樣品處理過(guò)程簡(jiǎn)單，靈敏度高，可快速測(cè)定，回收率能夠控制在90%～111%。但是要消除溶液中各種金屬離子的干擾，消除方法方法如下。

（1）消除Zn2+的干擾。首先將富集電位調(diào)到-1.2 V，攪拌富集80 s；然后將電位調(diào)到-1.0 V，靜止富集30 s，使鋅從汞膜中溶出，從而減少互化物。

（2）消除Cu2+的干擾。選擇質(zhì)量濃度為1 mg/L的鍺，以阻止銅與鎵的互化物的形成。

（3）消除Fe3+的干擾。待樣品消化完全后，取1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的鹽酸羥胺放入三角瓶中，在電熱板上加熱煮沸5 min，即可把Fe3+還原為Fe2+。

3.石墨爐原子吸收法測(cè)定尿液、血液中鉈的含量。

（1）尿液中鉈含量的測(cè)定。先將尿樣用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的HNO3酸化，再以PdCl2為基體改進(jìn)劑消除干擾，然后使用石墨爐原子吸收法直接測(cè)定尿樣中鉈的含量。該方法質(zhì)量濃度檢出限為0.56 μg/L，加標(biāo)回收率為98.8%～101.5%，該方法簡(jiǎn)單快速，精密度和穩(wěn)定性好，符合尿液中鉈的測(cè)定要求。

（2）血液中鉈含量的測(cè)定。由于血液的前處理過(guò)程比較復(fù)雜，且鉈為易揮發(fā)元素，容易在前處理過(guò)程中造成鉈損失，所以要先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HNO3酸化，再以質(zhì)量濃度為1 g/L的釩為基體改進(jìn)劑消除干擾，放入微分電位儀測(cè)定全血中的鉈含量，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度較高，符合血液中鉈檢測(cè)的要求。

4.微分電位溶出分析法測(cè)定臟器（肝、腎、肺）中的鉈。取樣品1 g，倒入聚四氟乙烯消化罐中，再加入3 mL消化液，在170℃時(shí)消化12 h，用物質(zhì)的量濃度為5 mol/L的NaOH將pH值調(diào)為7，并定容至100 mL。取上述溶液1 mL倒入50 mL小燒杯中，加入物質(zhì)的量濃度為0.3 mol/L的醋酸和物質(zhì)的量濃度為0.25 mol/L的醋酸鉀緩沖溶液各5 mL、物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的EDTA2.5 mL和水16.5 mL，放入電位溶出分析法儀測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)加入法定量（鉈的溶出電位為-0.7 V），該方法靈敏度、準(zhǔn)確度高。

5.氫化物原子熒光測(cè)定法測(cè)定尿液中鉛的含量。將1.0 mL尿樣倒入濃HNO3蕩洗過(guò)的100 mL三角瓶中，加2 mL混合酸溶液（混合酸溶液中HNO3與HClO3體積比為3∶1），在電熱板上消化至無(wú)色近干后取下。加5.0 mL去離子水，搖勻后取2.0 mL置于一次性塑料管中，再加入0.4 mL混合溶液（由質(zhì)量濃度為80 g/L的鐵氰化鉀和質(zhì)量濃度為4 g/L的草酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的HCl組成）和1.6 mL去離子水，搖勻，放入原子熒光光度計(jì)測(cè)定。該方法質(zhì)量濃度的檢出限為0.2 μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%。

6.涂鑭石墨管-石墨爐原子吸收光譜測(cè)定法測(cè)定尿液中的微量鋇。先將熱解平臺(tái)石墨管放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.4%的硝酸鑭溶液中浸泡24 h，再用超聲處理15 min，以趕盡石墨管表面的氣泡，使涂層均勻。自然風(fēng)干后，放入烘箱中，在120℃條件下干燥2 h，把石墨管兩端及外面用紙擦干凈，以防止石墨管污染石墨錐。將其放入石墨爐中，在120℃條件下加熱30 s，900℃條件下加熱30 s，2 000℃條件下加熱10 s，2 600℃條件下加熱10 s，連續(xù)加熱3次，加熱時(shí)氬氣流速為250 mL/min。尿樣用100+2比例（尿樣與濃酸的體積比為100∶2）的濃酸消化，將有機(jī)物質(zhì)破壞，使鋇以離子形式存在于待測(cè)液中，有利于鋇的原子化。該方法以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的硝酸銨和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的硝酸鎂為混合基體改進(jìn)劑，改善尿樣中的基體，可以有效消除背景吸收，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.4%的硝酸鑭涂層平臺(tái)石墨管，能有效抑制碳化鋇的生成，此外，涂層石墨管也避免了高溫石墨管本身在可見(jiàn)區(qū)的強(qiáng)輻射，有利于尿樣中微量鋇的測(cè)定。該測(cè)定方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高。

7.石墨爐原子吸收法直接測(cè)尿液、血清中鉻的含量。

（1）尿液中鉻含量的測(cè)定。尿樣按100+2的比例（尿樣和濃HNO3的體積比為100∶2）加入濃HNO3消化，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NH4NO3為基體改進(jìn)劑，用石墨爐原子吸收法測(cè)定尿液中鉻的含量。該方法用NH4NO3為基體改進(jìn)劑，改善尿樣基體，減少背景干擾，樣品不需繁瑣的預(yù)處理，減少了樣品污染和損失的機(jī)會(huì)。該方法簡(jiǎn)便、快速，適用于大批量的尿樣中鉻含量的測(cè)定，該方法測(cè)定的精密度和準(zhǔn)確度較好，質(zhì)量濃度檢出限為0.12 μg/L。

（2）血清中鉻含量的測(cè)定。將血清用濃HNO3酸化，以質(zhì)量濃度為4 mg/L的硝酸鎂作為基體改進(jìn)劑，放入石墨爐原子吸收光譜儀測(cè)定血清中鉻的含量。該方法樣品不需進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)前處理即可測(cè)定，克服了生物樣品背景吸收過(guò)大的缺點(diǎn)，減少了污染，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，降低了誤差，大大縮短了分析時(shí)間，且質(zhì)量濃度檢出限低，經(jīng)方法學(xué)研究和對(duì)若干份混合血清樣品測(cè)定，均取得了滿意的結(jié)果。

二、生物樣品中有機(jī)化學(xué)毒物快速鑒定技術(shù)研究

1.帶捕集阱頂空-氣相色譜法技術(shù)（FID）應(yīng)用研究。采用正交設(shè)計(jì)方法，以四氯乙烯為研究對(duì)象，探討用捕集阱頂空-氣相色譜法測(cè)定氯代烴的最佳條件，包括測(cè)定氯代烴時(shí)所采用的溫度、時(shí)間、壓強(qiáng)等檢測(cè)條件，并對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了使用頂空儀器的最佳條件：取樣針溫度100℃，傳輸線溫度100℃，爐溫80℃，保溫時(shí)間30.0 min，干吹時(shí)間2.5 min，捕集阱保持時(shí)間6.0 min，解析時(shí)間1.1 min，加壓時(shí)間1 min，釋壓時(shí)間0.8 min，色譜柱壓強(qiáng)275.79 kPa，瓶壓強(qiáng)206.84 kPa，解吸壓強(qiáng)103.42 kPa。所得最佳條件可應(yīng)用于生物樣品中氯代烴的測(cè)定。

2.帶捕集阱頂空-氣相色譜法測(cè)定血液中四氯乙烯的含量。用5 mL肝素鈉真空抗凝管采集靜脈血5 mL，搖勻，抽取2 mL肝素鈉抗凝全血于頂空樣品瓶中，注入3 mL的蒸餾水，立即密封好頂空瓶口，進(jìn)行測(cè)定。用帶捕集阱頂空儀進(jìn)樣，經(jīng)氣相色譜儀（Elite-5MS毛細(xì)管柱）分離后使用氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)，峰形分離較為理想。溫度超過(guò)70℃時(shí)，血液會(huì)凝固，因此頂空儀爐溫設(shè)為65℃，以減少傳統(tǒng)分析方法中對(duì)血液的復(fù)雜前處理，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可對(duì)高濃度四氯乙烯接觸者的血液中四氯乙烯的濃度進(jìn)行檢測(cè)。

3.帶捕集阱頂空-氣相色譜電子捕獲（ECD）法測(cè)定血液中四氯乙烯的含量。樣品經(jīng)帶捕集阱頂空儀前處理后進(jìn)入氣相色譜儀，經(jīng)Elite-1701毛細(xì)管柱分離后使用電子捕獲檢測(cè)器測(cè)定四氯乙烯含量。該方法不僅降低了血液中碳?xì)溆袡C(jī)物質(zhì)的干擾，而且提高了靈敏度，ECD檢測(cè)器信號(hào)強(qiáng)度比FID檢測(cè)器提高了大約30倍，校準(zhǔn)曲線線性范圍為0～160 μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，質(zhì)量濃度檢出限達(dá)到0.9 μg/L，對(duì)高、中、低濃度樣品進(jìn)行測(cè)定，精密度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.15%，4.46%，4.77%，回收率為90%～110%。該方法適用于對(duì)低濃度四氯乙烯接觸者以及正常人群血液中四氯乙烯濃度的檢測(cè)，而且操作方便，適宜于做大批樣本的測(cè)定。

4.帶捕集阱頂空-氣相色譜法測(cè)定血液中揮發(fā)性氯代烴的含量。該方法以三氯乙烯為研究對(duì)象，探討三氯乙烯測(cè)定條件和方法的線性關(guān)系、質(zhì)量濃度檢出限、回收率及穩(wěn)定性。校準(zhǔn)曲線線性范圍為0～80μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 2，質(zhì)量濃度檢出限為0.5 μg/L。在線性范圍內(nèi)，分別對(duì)高、中、低濃度樣品進(jìn)行測(cè)定，精密度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.05%，7.28%，7.44%，回收率為96.83%～105.00%。該方法同時(shí)可用于血液中三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烯和四氯乙烯等揮發(fā)性氯代烴的測(cè)定。

5.血清中毒鼠強(qiáng)含量的快速化學(xué)檢測(cè)方法研究。以硫酸為分解劑，變色酸為顯色劑，測(cè)定血清中的微量毒鼠強(qiáng)。該方法靈敏度高，質(zhì)量濃度檢測(cè)下限達(dá)到0.1 mg/L，檢測(cè)成本低，實(shí)用性強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、快捷。

6.分光光度法快速測(cè)定尿液中百草枯的含量。先以酸沉淀法或?yàn)V紙過(guò)濾法消除蛋白質(zhì)的干擾，再通過(guò)百草枯與連二亞硫酸鈉反應(yīng)生成的有色物質(zhì)來(lái)定性。定量檢測(cè)常用方法有兩種。

（1）方法一。用塑料試管取尿液4 mL，加入物質(zhì)的量濃度為1 mol/L的HCl溶液酸化，搖勻，離心分離15 min（離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3 500 r/min）后，取上層清液2.5 mL加人另一個(gè)塑料試管，加入0.5 mL物質(zhì)的量濃度為1 mol/L NaOH溶液，然后加入2 mLNH4C1-NH3溶液（pH=10.3），最后加入4滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的連二亞硫酸鈉，倒入比色皿比色，比色時(shí)吸收波長(zhǎng)為395 nm。通過(guò)工作曲線紫外光度法來(lái)定量，獲得了滿意的結(jié)果。

（2）方法二。取2.5 mL樣品，加入2.5 mL水、0.3 g無(wú)水碳酸鈉和0.1 g碳酸氫鈉，搖勻，用慢速定量濾紙過(guò)濾，濾液倒入比色皿比色，比色時(shí)吸收波長(zhǎng)為396 nm，所得吸光度為尿樣的空白吸光度A0；將比色皿中的溶液倒回原試管中，加入0.05 g連二亞硫酸鈉，搖勻，再于396 nm比色，所得吸光度為樣品吸光度A樣0（即A樣-A0），通過(guò)線性回歸方程計(jì)算得到的值乘以2即為尿中百草枯的濃度。

三、全自動(dòng)微量元素分析儀

筆者所在項(xiàng)目組研發(fā)的全自動(dòng)微量元素分析儀以電化學(xué)原理為測(cè)定依據(jù)，將測(cè)試杯轉(zhuǎn)盤(pán)裝置中的轉(zhuǎn)盤(pán)安裝在機(jī)架上并通過(guò)傳動(dòng)機(jī)構(gòu)與轉(zhuǎn)盤(pán)電機(jī)連接，轉(zhuǎn)盤(pán)在垂直平面內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)，其圓周體壁均勻安裝一定數(shù)量的固定套，每一個(gè)固定套中安裝一個(gè)測(cè)試杯，二者為轉(zhuǎn)動(dòng)配合，并在測(cè)試杯下部套裝固定齒輪，該齒輪和測(cè)試杯轉(zhuǎn)動(dòng)電機(jī)的齒輪相連接。自動(dòng)微量元素分析儀包含測(cè)試杯轉(zhuǎn)盤(pán)裝置、電極裝置、樣品盤(pán)、自動(dòng)加樣裝置、底液或活化液加液裝置、清洗裝置及計(jì)算機(jī)控制裝置。該發(fā)明使用電子技術(shù)控制分析儀，各個(gè)機(jī)械裝置自動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)，具有自動(dòng)加樣、自動(dòng)加活化液、自動(dòng)測(cè)量、自動(dòng)記錄、自動(dòng)清洗測(cè)試杯和自動(dòng)干燥測(cè)試杯等功能，檢測(cè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，并且具有設(shè)計(jì)新穎、測(cè)量精度高等優(yōu)點(diǎn)。

本文，筆者所研究的各種方法和技術(shù)不但適用于職業(yè)中毒或自殺投毒等中毒患者的診斷，還可以為化學(xué)中毒應(yīng)急救治提供依據(jù)，也可以用于職業(yè)人群的健康體檢。所研發(fā)的全自動(dòng)微量元素分析儀可以廣泛應(yīng)用于水質(zhì)分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床檢驗(yàn)、保健普查、疾病控制等領(lǐng)域，如環(huán)保部門(mén)對(duì)廢水、廢氣、廢物中的微量元素的監(jiān)測(cè)，衛(wèi)生部門(mén)對(duì)生物材料、生活用品、飲用水、食品等物質(zhì)中微量元素的檢測(cè)等。

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目（0124170401）。