高 燕，張國(guó)平，劉培培，訾言勤

(淮北師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 淮北 235000)

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，可與很多內(nèi)源和外源物質(zhì)結(jié)合，研究藥物與血清蛋白的相互作用，對(duì)于了解藥物的作用機(jī)理具有重要的生物學(xué)及臨床意義，是一個(gè)引人注目的課題[1－5].而農(nóng)藥分子與蛋白分子作用特征的熒光法研究的有關(guān)報(bào)道相對(duì)較少.

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽又稱甲維鹽，是從發(fā)酵產(chǎn)品阿維菌素B1開始合成的一種新型高效半合成抗生素殺蟲劑[6]，其原藥按中國(guó)毒性標(biāo)準(zhǔn)分類為中等毒，制劑為微毒或低毒[7].本文首次采用熒光光譜法研究了甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽與牛血清白蛋白(BSA)間的相互作用，探討了它們的作用機(jī)制及結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合作用力類型.這對(duì)了解生物殺蟲劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在動(dòng)物體內(nèi)的代謝過程等方面具有重要的意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

RF－5301PC熒光光度計(jì)(日本島津公司);pHS－23型精密pH計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司);501型超級(jí)恒溫器(上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠).

稱取適量的 BSA(分析純，美國(guó) Amersco公司)溶于 pH 7.4 B.R 緩沖溶液，配制 1.0×10－5mol·L－1儲(chǔ)備液.稱取適量的EB(分析純)溶于乙醇(分析純)配制5.0×10－4mol·L－1的儲(chǔ)備液，均在0－4℃下保存.pH 7.4的B.R緩沖溶液，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在 10 mL 比色管中依次加入 pH 7.40的 B.R 緩沖溶液 1 mL，1.0×10－5mol·L－1BSA 溶液 0.5 mL 以及一定量5.0×10－4mol·L－1甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽溶液，用蒸餾水稀釋至刻線后混勻，在一定溫度下恒溫30 min，然后該溶液用1 cm石英比色皿，在激發(fā)波長(zhǎng)為277 nm，繪制300～440 nm的熒光光譜，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm和5 nm，掃描速度為 Low.并分別以 Δλ=15 nm和 Δλ=60 nm掃描其同步熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 甲維鹽與BSA的熒光猝滅類型

甲維鹽與BSA作用的熒光光譜圖如圖1.由圖1可見隨著甲維鹽的加入，BSA的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸降低.說明甲維鹽與BSA發(fā)生了相互作用，這種作用可能引起B(yǎng)SA中熒光發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境及蛋白質(zhì)分子構(gòu)象行為的變化[8].

判斷藥物小分子猝滅BSA熒光的機(jī)制是動(dòng)態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，主要根據(jù)熒光猝滅常數(shù)隨溫度的變化關(guān)系來確定，若熒光物質(zhì)的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大即為動(dòng)態(tài)猝滅，反之，即為靜態(tài)猝滅[9－11].根據(jù)不同溫度下甲維鹽猝滅BSA的Stern－Volmer曲線圖[12](見圖2)，求相應(yīng)Stern－Volmer方程的猝滅常數(shù)，數(shù)據(jù)見表1.

表1 不同溫度下甲維鹽對(duì)BSA的猝滅常數(shù)

從表1結(jié)果來看，猝滅常數(shù) Kq隨溫度的升高而增大，因此甲維鹽猝滅BSA熒光的機(jī)制是動(dòng)態(tài)猝滅.

2.2 甲維鹽與BSA的表觀結(jié)合常數(shù) Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n

分別在290 K，300 K，310 K溫度下作lg(Fo－F)/F－lg[Q]的雙對(duì)數(shù)圖[13－14]，由圖3的線性方程求得不同溫度的表觀結(jié)合常數(shù) Kb和結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n，數(shù)據(jù)見表2.由表2可知，甲維鹽與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨溫度300 K升高到310 K，增大較明顯，從290 K到300 K增加較平緩，由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，導(dǎo)致表觀結(jié)合常數(shù) Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n增加，進(jìn)一步說明它們的作用機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅.從表2中還可看出甲維鹽與BSA表觀結(jié)合常數(shù) Kb值約為103數(shù)量級(jí)，說明甲氨基阿維菌素結(jié)合作用的強(qiáng)度一般.

表2 不同溫度下甲維鹽與BSA的表觀結(jié)合常數(shù) Kb以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù) n

2.3 甲維鹽與BSA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

由甲維鹽與BSA結(jié)合常數(shù)，計(jì)算出溫度分別為290 K，300 K，310 K時(shí)，甲維鹽與BSA作用的自由能變?chǔ) 分別為 － 17.432 kJ·mol－1， －20.630 kJ·mol－1， － 28.514 kJ·mol－1，焓變 ΔH 為 144.83 kJ·mol－1(反應(yīng)的焓變視為常數(shù))，熵變 ΔS 分別為 559.52 J·mol－1·K－1、551.53 J·mol－1·K－1、559.17 J·mol－1·K－1.根據(jù)Ross等總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律[15]推斷出甲維鹽與BSA之間的主要作用力是疏水作用.

2.4 同步熒光光譜

甲維鹽與BSA作用的同步熒光光譜圖見圖4，由圖4可知色氨酸殘基特征熒光光譜峰隨著甲維鹽濃度增加產(chǎn)生猝滅效果較酪氨酸大[16]，說明甲維鹽主要與色氨酸殘基結(jié)合，而兩者峰位值未發(fā)生改變，進(jìn)一步說明甲維鹽對(duì)BSA的猝滅方式為動(dòng)態(tài)猝滅，且甲維鹽加入幾乎沒有使牛血清白蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化[17].

圖4 同步熒光光譜(a):Δλ=15 nm;(b)Δλ=60 nmc甲維鹽 =5.00 × 10 －5mol·L－1From 1 to 9:0.00，0.30，0.60，0.90，1.20，1.50，1.80，2.10，2.40

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)主要研究甲維鹽與牛血清白蛋白BSA之間的相互作用，通過實(shí)驗(yàn)以及結(jié)果分析可以得出:甲維鹽對(duì)牛血清蛋白具有熒光猝滅效應(yīng)，通過對(duì)熒光猝滅速率常數(shù)的計(jì)算可以知道隨著溫度的升高，猝滅速率常數(shù)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，所以可以判定此熒光猝滅過程是一個(gè)動(dòng)態(tài)的熒光猝滅過程.通過對(duì)熒光猝滅過程中熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算可以知道，此復(fù)合過程是自發(fā)進(jìn)行的，甲維鹽與BSA之間的結(jié)合主要是靠疏水作用力.通過對(duì)加入藥物的BSA進(jìn)行同步熒光掃描可以知道，甲維鹽對(duì)BSA的構(gòu)象沒有影響.

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