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      百里香染色體制片優(yōu)化及核型分析

      2012-08-20 04:06:14楊寧談永霞李巧峽賈凌云陳錫蓮劉效瑞
      草業(yè)學報 2012年1期
      關(guān)鍵詞:百里香核型數(shù)目

      楊寧,談永霞,2,李巧峽,賈凌云,陳錫蓮,劉效瑞

      (1.西北師范大學生命科學學院,甘肅 蘭州730070;2.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅 蘭州730070;3.定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心,甘肅 定西743000)

      百里香(Thymus mongolicus),又名地姜、地椒、麝香草,為唇形科百里香屬植物。百里香的株型奇特低矮,花型小,花色艷麗,且全株芳香,喜涼爽氣候,喜光,稍耐蔭,耐寒耐旱,忌濕,耐貧瘠[1]。百里香屬植物原產(chǎn)于地中海沿岸,全球約有400多個種,廣泛分布在北非、歐洲和亞洲溫帶地區(qū),經(jīng)濟栽培以南歐最多[2]。我國有11種,2個變種,分布于甘肅、新疆、青海、西藏及黃河流域及以北地區(qū)[3]。百里香屬植物具有分布廣泛、適應性強、種內(nèi)多型性較為普遍等特點,在溫帶干旱半干旱地區(qū)的荒漠化生境的植物群落組成及生態(tài)演替中發(fā)揮著重要的生態(tài)功能[4,5]。作為一種頗具開發(fā)價值的多用途植物,近年來,百里香作為芳香蔬菜、藥用植物、香料作物、蜜源植物、觀賞植被及干旱土壤的水土保持植物被大面積種植[6]。

      形態(tài)學分類方法是最基本的植物分類方法,在植物分類研究中一直沿用。但是由于百里香屬植物不同種之間的形態(tài)差異較小,加之近年來國外品種的大量引進,所以,僅以形態(tài)學方法難以提供可靠的分類依據(jù),亟需采用多種方法來加強百里香屬植物的分類研究[1]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,分子標記及基因序列的分析方法已被廣泛應用于物種的親緣關(guān)系、遺傳變異及系統(tǒng)演化的研究。由于分子的研究方法是基于染色體上的一段DNA序列,因此其結(jié)果有時不如用染色體組分析法直觀[7]。染色體核型分析技術(shù)能明確識別各個染色體的特征,有助于基因定位的研究,它是細胞遺傳學的一項基本技術(shù),也是染色體工程、細胞分類學和植物育種學的一個不可缺少的手段。對染色體進行核型分析,不僅有助于了解生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機制,而且對預測鑒定種間雜交和多倍體育種的結(jié)果、了解性別遺傳機理以及基因組數(shù)、物種起源、進化和種族關(guān)系的鑒定都具有重要的參考價值[8,9]。通過對細胞核染色體核型穩(wěn)定特征(染色體的數(shù)目、相對長度、著絲點位置、核型不對稱系數(shù)和隨體的有無等)的分析,可以作為分類指標而被利用。因此,染色體核型分析技術(shù)可為研究生物的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系提供依據(jù)[10]。

      由于百里香屬植物的染色體非常小,為1~2μm,一般較難觀察,所以國內(nèi)外對百里香屬植物染色體數(shù)目、核型分析的研究的相關(guān)報道極少,國內(nèi)僅見權(quán)俊萍等[11]對我國產(chǎn)4種2個變種百里香屬植物進行了染色體數(shù)目及核型分析研究,國外對百里香屬植物的研究較為廣泛和深入,并依據(jù)形態(tài)學差異及地理分布特點等將其分為Micantes,Mastichina,Piperella,Teucrioides,Pseudothymbra,Thymus,Hyphodromi和Serpyllum 等8個組,其中分布于亞洲的種多存在Hyphodromi和Serpyllum組中[12]。然而對我國百里香屬植物染色體的數(shù)目、核型分析方面的特征、染色體數(shù)目在種(變種)間的差異及其在百里香屬所在組等方面的基礎(chǔ)植物學問題仍有許多不清楚。筆者首次對甘肅康樂城郊百里香染色體制片技術(shù)進行了優(yōu)化并對其染色體進行了核型分析,旨在積累其細胞學資料,以期為甘肅地產(chǎn)野生百里香的系統(tǒng)分類、遺傳進化及遺傳育種提供一定的科學依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      采自甘肅康樂縣城郊百里香種子,挑選粒大飽滿的百里香種子放在墊有雙層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,于2009年11月置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)。

      1.2 方法

      百里香幼苗芽尖為材料,選取上午8:00-10:00,每隔15min取材1次,用0.02%秋水仙素處理3h,以確定適宜的取材時間;以0.01%~0.04%秋水仙素附加8-羥基喹啉溶液作為預處理液,處理2~4h,以確定適宜的預處理液,預處理液及處理時間見表1。取預處理后的材料,漂洗2~3次,置于卡諾固定液室溫下固定24h之后,用超純水漂洗固定的材料2~3次,于0.1mol/L HCl中,60℃水浴鍋內(nèi)恒溫分別解離5~25min,確定最適宜的解離時間;45%冰醋酸軟化10min后用清水沖洗3~4次,切取百里香芽尖生長點部分,置于載玻片中央,濾紙吸去多余液體,改良石炭酸品紅染色液分別染色10~80min,常規(guī)方法壓片[13],之后鏡檢,對分散較好的染色體裝片在100倍顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)下鏡檢并拍照。

      表1 預處理液及處理時間Table 1 Reagent and time for pretreatments

      核型分析采用李懋學等[14,15]提出的標準進行;根據(jù)Levan等[16]的命名法則,來確定染色體的著絲點位置;染色體核型分類按照Stebbins[17]提出的根據(jù)最長與最短染色體的比值和臂比值,來區(qū)分核型對稱和不對稱程度;染色體相對長度指數(shù)(I.R.L)參考 Kuo[18]提出的方法計算;核型不對稱系數(shù)(As.K)參考 Arano[19]的方法計算。相關(guān)公式為:

      2 結(jié)果與分析

      2.1 制片

      圖1 不同取材時間內(nèi)百里香中期細胞的百分比Fig.1 The percentage of the division cells in mitosis metaphase at different sampling times

      上午8:45-9:15是觀察百里香染色體數(shù)目比較好的時期,中期細胞的百分比最高可以達到40%(圖1),其他取樣時間雖然也可以觀察到中期分裂相的細胞,但所占比例較小,不易篩選出分散較好的染色體分裂相。以0.04%秋水仙素和0.002mol/L 8-羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2~3h,既發(fā)揮了秋水仙素累積分裂中期相的高效性,又保持了8-羥基喹啉能使染色體清晰,便于觀察的特點(表2)。另外,在60℃,0.1mol/L HCl中解離15min,后用45%冰醋酸軟化10min效果最佳;酸解5及10min由于細胞解離不充分,細胞不易分散,造成許多細胞重疊在一起,內(nèi)部細胞由于接觸不到染液而染色較淺,外部細胞卻由于細胞質(zhì)也著色,對比度低,染色體不容易觀察;酸解20及25min雖然解離比較充分,細胞容易分散,細胞質(zhì)也不易著色,但細胞中的染色體染色太淺而不易觀察,部分細胞由于解離過度而出現(xiàn)破裂,染色體也出現(xiàn)不同程度的破壞,斷裂成片段,影響染色體數(shù)目統(tǒng)計和核型分析(表3)。

      2.2 核型分析

      2.2.1 染色體數(shù)目 選擇30個染色體分散良好的細胞觀察計數(shù),其中26個細胞染色體數(shù)目為24條,占計數(shù)總數(shù)的86.7%;4個細胞染色體數(shù)目為26,占計數(shù)總數(shù)的13.3%。根據(jù)核型分析標準化建議[16],確定百里香染色體數(shù)目為2n=2x=24。

      2.2.2 染色體相對長度及核型分析 根據(jù)李懋學和陳瑞陽[14]提出的植物核型分析標準,進行百里香染色體核型分析。選擇30個百里香細胞進行染色體計數(shù),核型取5個細胞的平均值。測量染色體長臂和短臂,計算染色體相對長度、臂比值、染色體相對長度指數(shù),按照染色體總長度由長至短的順序?qū)θ旧w進行排列和編號(表4,圖2~4)。

      實驗結(jié)果可以得出百里香染色體的數(shù)目為2n=2x=24,其中第2號和第7號為近中部著絲粒染色體(sm),其余均為中部著絲粒染色體(m);由長染色體(L)、中長染色體(M2)、中短染色體(M1)和短染色體(S)4種染色體組成。核型公式為2n=2x=24=20m+4sm,核染色體相對長度在7.07%~13.13%,染色體長度比為1.86,染色體臂比大于2∶1的染色體占8.33%,按照Stebbins[17]的核型分類標準,百里香的核型屬2A型,核型不對稱系數(shù)為59.63%。

      表2 不同預處理液的效果比較Table 2 Effects of different reagent for pretreatment

      表3 不同解離時間的效果比較Table 3 Effect of different dissociation time

      表4 百里香染色體的核型參數(shù)Table 4 Karyotype parameters of chromosome in T.mongolicus

      圖2 百里香染色體形態(tài)Fig.2 The chromosome morphology of T.mongolicus

      圖3 百里香染色體的核型圖Fig.3 Karyotype of chromosome in T.mongolicus

      3 討論

      3.1 百里香染色體制片技術(shù)的探究

      根據(jù)李懋學等[14,15]提出的植物核型分析標準,確定百里香的染色體屬于小染色體,這給百里香染色體數(shù)目的統(tǒng)計和核型分析帶來很大困難。取材部位、取材時間、預處理液的種類和濃度、預處理時間、酸解的時間及方法、染色時間等都影響實驗的成敗。理論上講,任何時間取樣壓片,都可以從正常生長的根中獲得中期分裂相[20,21]。但是如果分裂相所占的比例很小,核型分析就十分困難。李國珍[22]認為,一般植物細胞染色體的分裂高峰期在上午的8:00-10:00,而董然等[23]在對長白山3種橐吾(Ligulariasibirica)的核型研究中,取材時間為上午10:00,趙振軍[24]在阿拉伯茶(Cathaedulis)細胞的研究中得出細胞集中分裂時間在上午8:30-11:30,閻素麗[25]在對向日葵(Helianthusannus)的核型分析中發(fā)現(xiàn)上午9:30-10:00是取材的最佳時間,而本實驗初步觀察到百里香在上午8:45-9:15間存在分裂高峰期,將近40%的細胞處于分裂中期,有利于篩選分散良好的百里香染色體用于核型分析。

      在染色體制片中對材料進行預處理主要是阻斷紡錘體的形成,使細胞分裂終止在中期階段,可提高中期分裂相的出現(xiàn)頻率。由于植物不同物種之間的差異性,不同植物所適合的預處理液一般不同。張永兵等[26]在對甜瓜(Cucumismelo)的核型分析中用對二氯苯和紡線菌酮的混合液預處理甜瓜根尖,獲得了主、次縊痕清晰、分散良好的中期染色體分裂相,張紅梅等[27]在青花菜(Brassicaoleracea)染色體核型分析中得出用0.002mol/L 8-羥基喹啉處理2.5h染色體分散性最好。本實驗確定在百里香染色體制片中以0.04%秋水仙素和0.002mol/L 8-羥基喹啉等體積混合溶液預處理百里香芽尖2~3h,秋水仙素累積分裂中期相最多,結(jié)合8-羥基喹啉又能使染色體更清晰、便于觀察。

      圖4 百里香染色體的核型模式圖Fig.4 Karyotype pattern of chromosome in T.mongolicus

      3.2 百里香的遺傳分類學探討

      國外對百里香屬內(nèi)各組部分種的研究結(jié)果表明,Micantes組染色體為二倍體,染色體數(shù)目為30,Mastichina組的染色體為二倍體和四倍體,染色體數(shù)目有30,58,60,染色體基數(shù)多為15或15的倍數(shù);Piperella組的染色體為二倍體,基數(shù)為14;Pseudothymbra組的染色體包括有二倍體和四倍體,染色體數(shù)目包括28,30,56,染色體基數(shù)為14,15或相應的倍數(shù);Thymus組的染色體比較復雜,染色體數(shù)目包括有28,30,54,56,58,基數(shù)多為14,15,27,28,29;Hyphodromi組染色體數(shù)目有26,28,42,54,56,58,60,62,84,90,染色體基數(shù)包括13,14,21及它們的倍數(shù)等等;Serpyllum組同 Hyphodromi組較相似,染色體數(shù)目有24,26,28,30,32,35,52,56,58,84,90,染色體基數(shù)包括12,13,14,21等[11,28]。本實驗結(jié)果表明,甘肅康樂地產(chǎn)野生百里香的染色體為2倍體:2n=2x,染色體基數(shù)為12,對比國外報道的百里香屬各組的染色體數(shù)目資料,初步比較發(fā)現(xiàn)產(chǎn)自甘肅康樂縣的百里香染色體數(shù)目及形態(tài)特征與百里香屬內(nèi)的Serpyllum組在染色體基數(shù)及數(shù)目方面較為相似。一般認為,核型進化的基本趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展的,系統(tǒng)演化上處于比較古老或原始的植物,大多具有較對稱的核型,而不對稱的核型則常見于衍生的、特化的以及比較進化的植物類群中[15]。核型不對稱系數(shù)越接近50%,核型的對稱程度越高,進化程度越原始,對甘肅地產(chǎn)百里香核型不對稱系數(shù)和核型類型分析,百里香的核型不對稱系數(shù)為59.63%,接近于50%,具有較大的對稱性;其核型屬2A型,表明甘肅地產(chǎn)百里香在百里香屬中是相對較為原始的。而權(quán)俊萍等[11]對我國4種、2個亞種百里香屬植物的研究結(jié)果中表明,除百里香種未確定外,其他3種及2個亞種的核型均為2B,說明它們在百里香屬中是比較進化的,這與對甘肅康樂縣地產(chǎn)百里香核型的研究結(jié)果有一定的差異,推測甘肅康樂地產(chǎn)百里香在百里香屬中是比較原始,不能歸屬于上述3種。關(guān)于其在百里香屬內(nèi)的系統(tǒng)地位問題,還需進一步研究,才能作出準確判斷。

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