解毒化瘀法灌腸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎慢性期P-selectin指標(biāo)的影響

劉 亞，林 燕，李興廣

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)的病理特點(diǎn)是結(jié)腸黏膜及黏膜下層形成慢性炎癥和潰瘍，反復(fù)發(fā)作、遷延難愈是其病理特點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的重點(diǎn)。本課題采用緩解期解毒化瘀中藥持續(xù)灌腸治療在抗復(fù)發(fā)方面取得較好療效，通過(guò)動(dòng)態(tài)觀測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜P-selectin水平變化，探討解毒化瘀方的抗復(fù)發(fā)機(jī)理。

1 方法

1.1 材料

動(dòng)物:清潔級(jí)健康 Wistar大鼠，雌雄各半，體重160g～200g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(京)2006-0009);清潔級(jí)健康新西蘭家兔，體重約2000g，由北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供(動(dòng)物合格證號(hào)0003738)。試劑:三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)、弗氏完全佐劑 (Sigma公司)、P-selectin antibody(abcam)、20%福爾馬林、10%水合氯醛。藥物:解毒化瘀方(黃連、黃芩、苦參、三七粉等)(北京同仁堂藥店);奧沙拉嗪(中日友好醫(yī)院)。

1.2 方法

1.2.1 造模 采用家兔結(jié)腸黏膜-TNBS/乙醇液的免疫化學(xué)法造模。

1.2.2 分組設(shè)計(jì)與給藥 分兩個(gè)階段。將260只大鼠隨機(jī)分為4組，正常組50只，模型組50只，中藥組(解毒化瘀方)80只，西藥組80只。第一階段為急性期第1～2周(相當(dāng)于UC發(fā)作期)。中藥組給予解毒化瘀方灌腸給藥，西藥組給予奧沙拉嗪灌腸給藥，正常組、模型組用潔凈水灌胃。第二階段為慢性期第3～4周(相當(dāng)于 UC緩解期)。將上述急性期的中藥灌腸組隨機(jī)分為中藥持續(xù)灌腸組和中藥停藥組2組，中藥灌腸組繼續(xù)解毒化瘀方灌腸治療，中藥停藥組停止中藥灌腸;同樣，將上述急性期的西藥灌腸組也隨機(jī)分為西藥持續(xù)灌腸組和西藥停藥組2組，西藥灌腸組繼續(xù)奧沙拉嗪灌腸治療，西藥停藥組停止西藥灌腸。正常組、模型組、中藥停藥組、西藥停藥組均用潔凈水灌胃。

1.2.3 取材與處理 于造模后第1天在造模組中隨機(jī)選擇10只取材，再分別于給藥后1周末、2周末、3周末和4周末每組隨機(jī)取10只大鼠殺檢取材，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。以10%水合氯醛腹腔麻醉后剖檢，腹主動(dòng)脈采血。然后截取自肛門(mén)以上8cm～12cm處病變結(jié)腸約1cm。將采集標(biāo)本投入20%福爾馬林液中常溫保存72 h，將標(biāo)本脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、6μm厚切片。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) P-selectin免疫組化操作步驟:①脫蠟，水化組織切片;②3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;③PBS沖洗，3 min×3次;④滴加一抗(P選擇素稀釋50倍)，4℃過(guò)夜;⑤PBS沖洗3 min×3次;⑥滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;⑦滴加試劑2，室溫孵育20 min，PBS沖洗3 min×3次;⑧DAB溶液顯色(稀釋20倍);⑨去離子水沖洗、復(fù)染、脫水、透明和封片。NIKON顯微照相系統(tǒng)觀察病理改變，顯示各組組織學(xué)結(jié)構(gòu)或病變特征。

2 結(jié)果

2.1 UC急慢性不同時(shí)期病理機(jī)制的異同

2.1.1 不同時(shí)間非給藥 UC大鼠 P-selectin Mean Density表達(dá)的變化 表1顯示，不同時(shí)間非給藥組UC大鼠與正常組大鼠P選擇素表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05);隨時(shí)間推移，UC大鼠 P選擇素陽(yáng)性表達(dá)依次減小，且有顯著性差異，但仍明顯高于正常組大鼠(P＜0.05)。

表1 不同時(shí)間非給藥UC大鼠P-selectin Mean Density的變化

2.2 中西藥灌腸對(duì) P-selectin Mean Density表達(dá)的影響

2.2.1 比較慢性期中、西藥對(duì) P-selectin Mean Density表達(dá)的調(diào)控 表2顯示，在慢性期，中西灌腸組大鼠與正常組大鼠相比P-selectin表達(dá)較高，且有極顯著差異，而在第4周末中藥灌腸組與正常組更接近;慢性期中、西藥灌腸組與模型組相比 P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;同時(shí)期中藥灌腸組與西藥灌腸組相比P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;中藥灌腸組第4周末與第3周末相比P-selectin表達(dá)較低，有極顯著差異;西藥灌腸組第4周末與第3周末相比P-selectin表達(dá)較低，有極顯著差異。

表2 比較慢性期中、西藥灌腸組P-selectin Mean Density的表達(dá)

2.3 比較緩解期中西藥持續(xù)灌腸與停藥的療效差異

2.3.1 比較緩解期中藥灌腸與中藥停藥的療效 表3顯示，在慢性期第4周末中藥灌腸組與正常組最接近，但仍有顯著差異;其他組大鼠與正常組相比，P-selectin表達(dá)較高，且有極顯著差異;慢性期中藥灌腸組和停藥組大鼠與模型組大鼠相比，P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;慢性期中藥灌腸組與中藥停藥組相比P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;中藥灌腸組第4周末與第3周末相比表達(dá)降低，有極顯著差異;中藥停藥組第4周末與第3周末相比表達(dá)降低，有顯著差異。

表3 緩解期中藥灌腸組與中藥停藥組P-selectin Mean Density表達(dá)的異同

2.3.2 比較緩解期西藥灌腸與西藥停藥的療效 表4顯示，在慢性期西藥灌腸組和停藥組大鼠與正常組相比，P-selectin表達(dá)較高，且有極顯著差異;西藥灌腸組和停藥組大鼠與模型組大鼠相比，P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;慢性期西藥灌腸組與西藥停藥組相比，P-selectin表達(dá)較低，且有極顯著差異;西藥灌腸組第4周末與第3周末相比，表達(dá)降低，有極顯著差異;西藥停藥組第4周末與第3周末相比表達(dá)降低，有顯著差異。

3 結(jié)論

資料表明，P-selectin屬黏附分子選擇素家族的組分之一，由活化血小板、內(nèi)皮細(xì)胞分泌表達(dá)，并可作為這些細(xì)胞活化的標(biāo)志，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)活化血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，是活化血小板最特異和敏感的分子標(biāo)志物［1］。研究證實(shí)，UC患者血漿中 P選擇素的含量明顯高于健康人，雖然緩解期患者其含量有所下降，但仍然明顯高于正常組［2］。它在 UC發(fā)病機(jī)制中可能的作用是:①活化的血小板通過(guò)局部釋放炎癥介質(zhì)、化學(xué)趨化物(如PF4、PAF)及激活其他炎癥細(xì)胞參與和增強(qiáng)腸黏膜炎癥過(guò)程;②血小板活化及其衍生的 TXA2易使血小板聚集阻塞腸黏膜微循環(huán)，加重腸黏膜缺氧、損傷;③血小板衍生因子從活化的血小板釋放出來(lái)，在組織損傷后的修復(fù)中起重要作用［3］。

表4 緩解期西藥灌腸組與西藥停藥組P-selectin Mean Density表達(dá)的異同

3.1 初步明確潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)作期與緩解期的病理機(jī)制

微循環(huán)障礙貫穿UC的始終，急性期微循環(huán)障礙嚴(yán)重，慢性期微循環(huán)障礙持續(xù)存在，這種病理現(xiàn)象對(duì)腸黏膜屏障的修復(fù)有不利影響，可能是引起UC復(fù)發(fā)的病理機(jī)制。

3.2 闡明慢性期中西藥灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎各自療效優(yōu)勢(shì)及保護(hù)機(jī)制

在UC慢性期，中西藥持續(xù)給藥均可改善腸黏膜的微循環(huán)狀態(tài)，改善 UC模型大鼠的一般狀況。但這時(shí)中藥組的療效更為顯著。在慢性期末，中藥灌腸組的P-selectin指標(biāo)最接近正常值，可以認(rèn)為在緩解期改善微循環(huán)方面中藥較西藥更有優(yōu)勢(shì)。

3.3 證實(shí)緩解期中藥持續(xù)灌腸治療能夠更加有效地抗UC復(fù)發(fā)

慢性期，中西藥給藥組和停藥組均可見(jiàn)UC大鼠P-selectin Mean Density表達(dá)下降、一般狀況持續(xù)好轉(zhuǎn)和炎性反應(yīng)繼續(xù)減少。不同的是，給藥組的總體情況較停藥組改善更迅速，其中中藥給藥組的P-selectin Mean Density最接近正常組，而西藥給藥組次之。由此可見(jiàn)，與緩解期(慢性期)停藥相比，在緩解期中藥持續(xù)給藥對(duì)改善UC腸黏膜微循環(huán)裝填更具優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，微循環(huán)障礙貫穿UC的始終，急性期微循環(huán)障礙嚴(yán)重，慢性期微循環(huán)障礙持續(xù)存在，這可能正是UC復(fù)發(fā)的關(guān)鍵病理機(jī)制。在緩解期，中藥與西藥相比能更加顯著地改善微循環(huán)狀態(tài);在緩解期末，中藥持續(xù)給藥的療效已接近正常，可見(jiàn)緩解期中藥持續(xù)灌腸治療能夠更加有效地抗UC復(fù)發(fā)。

［1］趙亞鵬，金佩佩，周同，等.P-選擇素及其細(xì)胞黏附與血栓形成［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2007，29:22-26.

［2］楊權(quán)，陳守國(guó)，許寧.潰瘍性結(jié)腸炎患者血漿P選擇素的測(cè)定及其意義［J］.海南醫(yī)學(xué)，2004，10.8(5):322-325.

［3］Papalambros E，Sigala F，Travlou A，et al.P -selectin and antibodies against heparin-platelet factor 4 in patients w ith venous or arterial dis 2 eases after a 7-day heparin treatment［J］.J Am C oll Surg，2004 ，199(1):69-77.