RASSF1A 和P16 在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床病理意義

陶香香，陳 陽

(皖南醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年大約有30 萬食管鱗癌新增病例［1－2］。食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多因素共同參與的過程。Ras 相關(guān)區(qū)域家族1A(ras association domainfamily 1A，RASSF1A)是2000年發(fā)現(xiàn)的新型候選腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene，TSG)，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡方面具有重要作用，在肺、乳腺、腎、消化系統(tǒng)等部位的癌組織中存在不同程度的表達(dá)缺失［3－5］。p16 基因是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的抑癌基因之一，屬于cyclin-CDK 復(fù)合物的特異性抑制劑，是INK4 家族的重要成員。本研究旨在檢測RASSF1A 和P16 在食管鱗癌組織中的表達(dá)，進(jìn)一步探討RASSF1A 和P16 在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，為高危人群預(yù)防和診斷提供新的手段和方法。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2008年1～12月皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院住院并接受開放手術(shù)治療的90 例食管鱗癌患者的癌組織及其相應(yīng)的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣6～8 cm 以上的食管黏膜并經(jīng)病理檢查排除腫瘤累及)，所有病例術(shù)前均未經(jīng)任何抗癌藥物治療或放療。90 例食管癌患者中，男73 例，女17 例。年齡43～83歲，中位年齡為63歲。按2003年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)聯(lián)合制定的TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期38 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。按分化程度分為高、中、低分化各30 例;按大體類型分蕈傘型14 例，潰瘍型57 例，髓質(zhì)型14 例，縮窄型5 例。所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。

1.2 主要試劑 免疫組化法所需的羊抗人RASS F1A多克隆抗體和兔抗人P16 多克隆抗體購于北京中山生物技術(shù)公司。

1.3 方法 所有標(biāo)本常規(guī)用甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，HE 染色，光鏡觀察分級(jí)和分期。實(shí)驗(yàn)采用SP 免疫組化方法，2 名醫(yī)師雙盲法觀察切片，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用卡方檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) RASSF1A 陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)，P16 陽性染色位于細(xì)胞核，根據(jù)棕黃色陽性信號(hào)的強(qiáng)弱和面積判斷結(jié)果。①按陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分:陽性細(xì)胞＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。②按染色強(qiáng)弱計(jì)分:無色0 分，淡黃色1 分，黃色2分，棕褐色3 分。陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度的乘積:0～2 分為陰性(－)，3～8 分為陽性(+)，9～12分為強(qiáng)陽性(■)。

2.2 結(jié)果

2.2.1 RASSF1A 和P16 在正常食管黏膜組織和食管鱗癌組織中的表達(dá) 食管正常黏膜組織中RASSF1A 和P16 陽 性 表 達(dá) 率 分 別 為93.3% 和91.1%，而食管鱗癌組織中RASSF1A 陽性表達(dá)率51.1%，P16 陽性表達(dá)率41.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

2.2.2 RASSF1A 和P16 蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 RASSF1A 蛋白低表達(dá)與食管鱗癌的TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P ＜0.05)，與大體類型無關(guān)(P ＞0.05)。P16 蛋白低表達(dá)與食管鱗癌TNM 分期、浸潤深度密切相關(guān)(P ＜0.01)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和大體類型相關(guān)(P ＜0.05)。兩者表達(dá)皆與食管鱗癌患者的年齡、性別無關(guān)(P ＞0.05)，見表1。

表1 RASSF1A 和P16 在食管鱗癌中的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 1 The relationship of RASSF1A and P16 expression in ESCC and clinicopathological features

3 討論

RASSF1A 位于人染色體3p21.3 區(qū)位點(diǎn)，含340個(gè)氨基酸的開放閱讀框架，編碼相對分子質(zhì)量為38 800 ku的蛋白多肽。RASSF1A 是Ras 效應(yīng)家族中的一員，Ras 通路是所有細(xì)胞都有的一條高度保守的信號(hào)傳遞通路，Ras 蛋白在有活性的GTP 結(jié)合構(gòu)象和無活性的GDP 結(jié)合構(gòu)象之間轉(zhuǎn)化，通過與不同的效應(yīng)物分子作用激活多條傳遞通路，其中RAS/RASSF1/ERK 通路將信號(hào)由細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)細(xì)胞分化、增殖、存活及原癌基因轉(zhuǎn)化［6－8］.RASSF1A 蛋白通過磷酸化ATM 蛋白的激酶位點(diǎn)，使之活化來發(fā)揮抑制腫瘤的作用。研究表明，RASSF1A 在肺、乳腺、卵巢、胃等正常組織呈高表達(dá)，而在相應(yīng)的癌組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，且表達(dá)的陽性率與腫瘤的惡性程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期均相關(guān)［9－10］。本實(shí)驗(yàn)中RASSF1A 蛋白的低表達(dá)與食管鱗癌的TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與大體類型、性別、年齡無相關(guān)。

圖1 P16 在中分化食管鱗癌中的表達(dá)(×100)Fig 1 P16 expression in the moderately differentiated ESCC(HE，×100)

圖2 RASSF1A 在中分化食管鱗癌中的表達(dá)(×100)Fig 2 RASSF1A expression in the moderately differentiated ESCC(HE，×100)

p16 是一種直接參與細(xì)胞生長增殖負(fù)調(diào)控的抑癌基因，其編碼的蛋白被命名為P16 蛋白，通過競爭方式結(jié)合CDK4，抑制CDK4 活性，進(jìn)而阻止Rb 蛋白磷酸化，使細(xì)胞停滯于G0期，抑制細(xì)胞的分裂，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［11］。p16 基因定位于染色體9p21，長8.5 kb，由3 個(gè)外顯子和2 個(gè)內(nèi)含子組成。在人類多種腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、宮頸癌、消化系統(tǒng)腫瘤中均發(fā)現(xiàn)存在p16 基因的缺失［12］。本實(shí)驗(yàn)中P16 蛋白低表達(dá)與食管鱗癌的TNM 分期、大體類型、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與張曉麗等［13］報(bào)道相一致，而與年齡、性別無相關(guān)。

綜上所述，RASSF1A 蛋白和P16 蛋白的表達(dá)與食管鱗癌的TNM 分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，食管鱗癌的TNM 分期越高，表達(dá)越低，浸潤深度越深，表達(dá)越低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比未轉(zhuǎn)移組表達(dá)低;提示RASSF1A 蛋白和P16 蛋白表達(dá)降低促進(jìn)癌細(xì)胞的生物學(xué)行為惡化，使其侵襲和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)，最終將影響病人預(yù)后。由此推測，RASSF1A 蛋白和P16蛋白表達(dá)缺失的病例往往預(yù)后較差，這一結(jié)果與在子宮頸癌中的研究相似［14］，但有待于進(jìn)一步對隨訪病例的觀察。因此RASSF1A 蛋白和P16 蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)還需要繼續(xù)進(jìn)行深入研究，為食管鱗狀細(xì)胞癌早期診斷、預(yù)后判斷和干預(yù)治療提供了新思路。

［1］JENKINS TD，F(xiàn)RIEDMAN LS.Adenocarcinoma of the esophagogastric junction［J］.Dig Dis，1999，17:153－162.

［2］PARKIN D M.Global cancer statistics in the year 2000［J］.Lancet Oncol，2001，2(9):533－543.

［3］DAMMANN R，SCHAGDARSURENGIN U，SEIDEL C，et al.the tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis:an update［J］.Histol Histopathol，2005，20:645－663.

［4］DAMMANN R，LI C，YOON JH，et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3［J］.Nat Genet，2000，25:315－319.

［5］HAMILTON DW，LUSHER ME，LINDSEY JC，et al.Epigenetic inactiv-ation of the RASSF1A tumour suppressor gene in ependymoma［J］.Cancer Lett，2005，227:75－81.

［6］YOO YA，NA AR，LEE MS，et al.RASSF1A suppresses oncogenic H-Ras-induced c-Jun N-terminal kinase activation［J］.Int Oncol，2006，29:1541－1547.

［7］SONG MS，CHANG JS，SONG SJ，et al.The centrosomal protein RAS association domain family protein 1A(RASSF1A)-binding protein1 regulates mitotic progression by recruiting RASSF1A to spindle poles［J］.J Biol Chem，2005，280:3920－3927.

［8］PIJNENBORG JM，DAM-DE VEEN GC，KISTERS N，et al.RASSF1A methylation and K-ras and B-rafmutations and recurrent endometrial cancer［J］.Ann Oncol，2007，18:491－497.

［9］BYUN D S，LEEM G，CHAE K S，et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A by aberrant prom oter hyperm ethylation in human gastric adenocarcinom a［J］.Cancer Res，2001，61(19):7034－7038.

［10］AGATHANGGELOU A，COOPER W N，LATIF F，et al.Role of the Ras association dom ain family 1 tumor suppressor gene in human cancers［J］.Can cer Res，2005，65(9):3497－3508.

［11］THIERY JP.Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，46(2):442－454.

［12］LEE M，BERGMAN F，CHARLES N，et al.CtBPs Promote Cell Survival through the Maintenance of Mitotic Fidelity［J］.Mol Cell Biol，2009，38(12):4539－4551.

［13］張曉麗，蔣麗娜，程建君，等.p16、p27 蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)及意義［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞標(biāo)志，2005，14(4):439－442.

［14］林曉，徐軍，王紅琳，等.RASSF1A 和p16 基因甲基化在子宮頸癌組織中的表達(dá)及意義［J］.腫瘤，2007，27(9):727－729.