衛(wèi)文俊，陶霖玉，李蓉，陳玲，王玉蓉，曾鳳好

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院普外科，廣東深圳 518052)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是一類起病急、病情復(fù)雜、治療棘手的臨床常見急腹癥，其病情的演變及加重與繼發(fā)的局部和全身炎癥介質(zhì)的過度釋放、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory syndrome，SRIS)有關(guān)。烏司他丁(ulinastatin)是從人尿液中分離、純化的尿胰蛋白酶抑制劑。動物實(shí)驗(yàn)表明，烏司他丁對急性胰腺炎具有明顯的抗炎治療效果;部分臨床研究也提示其具有控制病情、緩解癥狀的作用。但關(guān)于其作用機(jī)制仍未完全明了，并存在爭議［1-2］。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)屬于一種病原微生物模式識別受體，作為脂多糖的跨膜受體，是炎癥反應(yīng)的門戶蛋白，在免疫防御反應(yīng)中起著十分重要的作用［3］。烏司他丁對急性胰腺炎引起的全身炎癥反應(yīng)的拮抗及抑制作用是否與抑制單核細(xì)胞表面Toll樣受體4的表達(dá)有關(guān)，目前尚不明確。本研究旨在觀察烏司他丁對重癥急性胰腺炎患者外周血單核細(xì)胞Toll樣受體4表達(dá)的影響，探討烏司他丁治療重癥急性胰腺炎的作用靶點(diǎn)及抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)會急性胰腺炎的臨床診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)(1996年第2次方案)，選擇2008年6月至2011年6月在我院住院的重癥急性胰腺炎患者58例，其中男31例，女27例，年齡28～62歲，平均(38±6)歲，隨機(jī)分為烏司他丁組(29例，予以常規(guī)治療+烏司他丁)、常規(guī)組(29例，予以常規(guī)治療)。另外，選擇20例健康志愿者作為對照組，其中男11例，女9例，年齡26～60歲，平均(35±5)歲。3組間性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 主要試劑和儀器

流式細(xì)胞儀CYTOMICS FC 500購自Beckman公司，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的抗人TLR4單克隆抗體購自eBioscience公司(美國)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人CD14單克隆抗體購自Beckman Coulter公司，TNF-α、IL-6 檢測試劑盒(Quantikine EL ISA Kit，R ＆D Systems)購自Minneapolis公司。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 (1)常規(guī)組:予以禁食、胃腸減壓、抑制胰酶活性、糾正水電解質(zhì)平衡、搶救休克、預(yù)防感染及營養(yǎng)支持等治療。(2)烏司他丁組:在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，予烏司他丁10萬U溶于5%葡萄糖注射液500 ml，靜脈滴注，每天2次，每次2 h滴完，3 d后改為10萬U，每天1次，療程7～14 d。

1.3.2 標(biāo)本的采集和處理 用無熱源的EDTA K2抗凝的無菌真空采集管采集SAP患者入院第1天治療前，入院后第3、5、7、14天的靜脈血各 15 ml。對照組僅采血1次。血標(biāo)本均在30 min內(nèi)處理:4℃離心5 min后，提取0.5 ml血漿，置冰箱－70℃凍存用于檢測細(xì)胞因子。

1.3.3 TLR4、CD14檢測 血標(biāo)本于12 h內(nèi)進(jìn)行直接免疫熒光標(biāo)記單核細(xì)胞表面CD 14和TLR 4，以流式細(xì)胞儀檢測CD 14和TLR 4表達(dá)。方法為100 μl全血 +5 μl TLR4-PE+10 μl CD14-FITC，避 光 孵 育20 min，加入 Optilyse C溶血素(Beckman Coulter公司)500 μl，溶血 10 min，1 500 × g 離心 5 min，加入2 ml PBS混勻，1 500 ×g離心 5 min，加入 500 μl PBS后上機(jī)檢測，以CD14圈門，檢測門內(nèi)細(xì)胞PE的平均熒光強(qiáng)度，用Mouse IgG2a作為同型對照。

1.3.4 血漿 TNF-α、IL-6的檢測 以 ELISA試劑盒檢測血漿TNF-α、IL-6水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3 組 TLR4、CD14 的表達(dá)

見表1。

表1 3組外周血單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

表1 3組外周血單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)變化(±s)Tab 1 The expression of TLR4 on PBMCs among the three groups( ±s)

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 5.01 ±1.21 － － － －常規(guī)組 29 11.86 ±2.59a 10.25 ±2.24b 8.65 ±2.89b 6.28 ±2.32b 5.10 ±2.74烏司他丁組 29 12.20 ±2.26a 8.02 ±2.45bc 6.21 ±3.21bc 5.05 ±2.36c 4.95 ±2.33

由表1可見，與對照組比較，在入院第1天常規(guī)組和烏司他丁組患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)明顯增高(均P＜0.01)，在入院治療后第3、5天 TLR4表達(dá)逐漸降低，但仍高于對照組(均P＜0.05)。烏司他丁組在入院后第7天TLR4表達(dá)與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，入院后第14天兩組TLR4表達(dá)均基本恢復(fù)正常。烏司他丁組與常規(guī)組在入院第1天治療前，外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而在治療后第 3、5、7 天烏司他丁組外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)均明顯低于常規(guī)組(P＜0.05)。CD14的表達(dá)在3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見表2)。

表2 各組外周血單核細(xì)胞CD14的表達(dá)變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

表2 各組外周血單核細(xì)胞CD14的表達(dá)變化(±s)Tab 2 The expression of CD14 on PBMCs among the three groups( ±s)

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.35 ±4.21 － － － －常規(guī)組 29 17.88 ±4.86 17.52 ±3.96 17.42 ±3.94 16.98 ±4.28 17.11 ±4.08烏司他丁組 29 17.69 ±5.20 17.54 ±5.36 17.29 ±4.57 17.19 ±4.12 17.23 ±5.14

2.2 3 組 TNF-α、IL-6 濃度的檢測

常規(guī)組和烏司他丁組入院第1天外周血TNF-α、IL-6的濃度均明顯高于對照組(P＜0.01)，入院治療后第3、5、7天逐漸降低，但仍較對照組增高(P＜0.05);烏司他丁組在治療后第3、5、7天，外周血TNF-α、IL-6的濃度與常規(guī)組對應(yīng)時點(diǎn)比較均明顯降低(P＜0.05，見表3、4)。

表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

表3 各組血漿中TNF-α濃度水平(±s)Tab 3 Blood concentration of TNF-α among the three groups( ± s) pg·ml－1

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 12.52 ±2.03 － － － －常規(guī)組 29 32.65 ±5.26a 29.87 ±4.96b 24.64 ±5.94b 20.57 ±4.38b 13.36 ±4.26烏司他丁組 29 33.15 ±6.12a 24.25 ±5.18bc 19.75 ±4.65bc 14.69 ±4.85bc 12.23 ±5.24

表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

表4 各組血漿中IL-6濃度水平(±s)Tab 4 Blood concentration of IL-6 among the three groups( ± s) pg·ml－1

與對照組比較，a P ＜0.01，b P ＜0.05;與常規(guī)組比較，c P ＜0.05

組 別 n入院時間/d 1 3 5 7 14對照組20 17.58 ±4.65 － － － －常規(guī)組 29 32.65 ±5.01a 28.77 ±4.85b 26.64 ±5.88b 21.57 ±4.12b 17.36 ±4.09烏司他丁組 29 31.21 ±6.25a 25.65 ±5.84bc 21.75 ±4.45bc 18.69 ±4.61bc 16.89 ±5.61

2.3 SAP外周血單核細(xì)胞 TLR4的表達(dá)與血漿TNF-α、IL-6 濃度的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析表明，常規(guī)組與烏司他丁組組內(nèi)對應(yīng)各時間點(diǎn)，SAP患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平與血漿TNF-α的濃度變化一致，二者具有正相關(guān)性(r=0.953，P＜0.05);血漿 IL-6 濃度的變化在各組內(nèi)對應(yīng)時間點(diǎn)與TLR4表達(dá)的變化亦具有正相關(guān)性(r=0.902，P＜0.5)。

3 討 論

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是近年來被認(rèn)識的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)的受體，且被認(rèn)為是炎癥瀑鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的閘門。TLRs屬于Ⅰ類跨膜受體，其胞外結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)刺激信號識別，而胞內(nèi)則是稱為Toll/IL-1R(TIR)的結(jié)構(gòu)域，與信號的傳導(dǎo)相關(guān)。TLRs廣泛分布于單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、內(nèi)皮細(xì)胞和樹突細(xì)胞等［4］，其配體包括脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)和脂蛋白等。現(xiàn)已在人體和小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種TLR，分別命名為 TLR1～TLR13。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是第一個被發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體，作為脂多糖(LPS)受體，介導(dǎo)LPS或內(nèi)毒素引起的胞內(nèi)信號傳遞，其激活將引起一系列下游分子的活化，最后激活通用轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，最終引起以TNF-a等為中心的前炎癥因子激活，導(dǎo)致多種炎癥因子的瀑鏈?zhǔn)结尫哦a(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［5］，因此，它可能作為急性炎癥反應(yīng)損傷的扳機(jī)點(diǎn)啟動機(jī)體的這種病理過程。有研究［6］表明，TLR4在急性胰腺炎觸發(fā)急性炎癥反應(yīng)的過程中具有重要作用，并與多器官功能障礙和腸源性感染的發(fā)生密切相關(guān)。因此，以TLR4為靶點(diǎn)控制這種瀑鏈?zhǔn)窖装Y反應(yīng)的有序性，可能是解決類似臨床問題的新方向［7］。

烏司他丁(ulinastatin)為一種糖蛋白，含有143個氨基酸，分子量約67 kD，是一種典型的Kuniz型的蛋白酶抑制劑，具有兩個活性功能區(qū)，兩個活性功能區(qū)均有很廣的抑酶譜，能夠同時抑制胰蛋白酶、磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶等多種水解酶的活性，同時烏司他丁不但對中性粒細(xì)胞蛋白酶具有較強(qiáng)的抑制作用，而且還能抑制白細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，其機(jī)制可能是通過阻斷蛋白酶所介導(dǎo)的中性細(xì)胞聚集，從而減輕了炎性介質(zhì)與氧自由基的釋放，有效制約了酶、細(xì)胞因子、氧自由基級聯(lián)反應(yīng)所形成的炎癥放大效應(yīng)［8］。烏司他丁用于重癥急性胰腺炎的治療，可改善臨床癥狀、提高治療效果，但其作用是否與抑制TLR4有關(guān)尚不明了。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比較，重癥急性胰腺炎早期，外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)明顯增高，隨后逐漸下降，至7 d左右恢復(fù)正常;血中TNF-α、IL-6濃度與TLR4變化一致。表明SAP早期可能通過先天性免疫門戶蛋白TLR4激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)NF-κB等下游信號因子，導(dǎo)致TNF-α等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。烏司他丁組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上，在發(fā)病早期即應(yīng)用烏司他丁治療，結(jié)果在治療后第3天始，外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)均比相應(yīng)常規(guī)組明顯降低，在各對應(yīng)時點(diǎn)TNF-α、IL-6濃度下降的更快，并且恢復(fù)時間也明顯縮短，由此推測，烏司他丁可能對外周血單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)有抑制作用，其對重癥急性胰腺炎引起的全身炎癥反應(yīng)的拮抗作用可能與其對TLR4表達(dá)的抑制進(jìn)而減少TNF-α、IL-6等炎癥因子有關(guān)。

綜上所述，重癥急性胰腺炎早期引起的全身炎癥反應(yīng)與外周血單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)異常有關(guān)，烏司他丁可能通過影響TLR4的表達(dá)起到抑制炎癥反應(yīng)進(jìn)而改善預(yù)后的作用，但其與TLR4具體的作用機(jī)制和相互關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

［1］TSUJINO T，KOMATSU Y，ISAYAMA H，et al.Ulinastatin for pancreatitis after endoscopic retrograde cholangiopancreatography:a randomized，controlled trial［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2005，3(4):376-383.

［2］CHEN C C，WANG S S，LEE F Y.Action of antiproteases on the inflammatory response in acute pancreatitis［J］.JOP，2007，8(4 Suppl):488-494.

［3］ KNUEFERMANN P，NEMOTO S，BAUMGARTEN G，et al.Cardiac inflammation and innate immunity in septic shock:is there a role for toll-like receptors［J］.Chest，2002，121:1329-1336.

［4］FRANTZ S，KELLY R A，BOURCIER T.Role of TLR2 in the activation of nuclear factor kappaB by oxidative stress in cardiac myocytes［J］.J Biol Chem，2001，276(7):5197-5203.

［5］YANG R B，MARK M R，GRAY A，et al.Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signaling［J］.Nature，1998，395(6699):284-288.

［6］SAWA H，UEDA T，TAKEYAMA Y，et al.Role of toll-like receptor 4 in the pathophysiology of severe acute pancreatitis in mice［J］.Surg Today，2007，37(10):867-873.

［7］NETEA M G，VANDER MEER J W，KULLBERG B J.Tolllike receptors as an escape mechanism from the host defense［J］.Trends Microbiol，2004，12(11):484-488.

［8］PARK W Y，GOODMAN R B，STEINBERG K P，et al.Cytokine balance in the lungs of patients with acute respiratory distress syndrome［J］.Am J Respiratory Crit Care Med，2001，164(10 Pt 1):1896-1903.