王開麗，張石蕊

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長沙 410128）

棉籽餅粕是一種營養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)原料，其含有蛋白質(zhì)約40%、賴氨酸1.59%和蛋氨酸0.52%，一直作為蛋白質(zhì)飼料用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，可在一定程度上替代豆粕等常規(guī)蛋白質(zhì)原料，彌補蛋白質(zhì)飼料資源的不足[1]。但是有毒物質(zhì)棉酚的存在限制了棉籽餅粕的大量使用。棉酚存在于棉籽色素腺體中，棉籽脫殼榨油后仍有部分棉酚殘留于棉籽粕中，若食用過量則會使動物中毒，甚至造成死亡。棉酚按存在形式可分為游離棉酚（FGP）和結(jié)合棉酚（UGP）兩種，兩者之和稱為總棉酚（TGP）。游離棉酚對動物有毒，因為其含有的活性基團羥基和醛基未被封閉，而結(jié)合棉酚的活性基團已與蛋白質(zhì)、磷脂、氨基酸等結(jié)合，對動物沒有毒性[2]。鑒于棉籽餅粕中游離棉酚有害，國家制定了游離棉酚的飼料衛(wèi)生標準，于1992年4月作為強制性標準頒布實施。飼料中游離棉酚允許量見附表。

附表 游離棉酚的允許量（GB 13078—2001）mg·kg-1

目前采用的棉籽餅粕去毒的方法是在棉籽餅粕中按其游離棉酚的含量來決定加入FeSO4的用量。其比例規(guī)定為游離棉酚∶FeSO4=1∶1。因此檢測棉籽餅中游離棉酚的含量是合理利用棉籽餅的一個重要技術指標。對游離棉酚的測定方法也多種多樣，目前已報道的游離棉酚檢測方法主要有比色法、紫外分光度法（UV）、高效液相色譜法（HPLC）和原子吸收分光光譜法（AAS）等，其中對飼料中游離棉酚的檢測以苯胺法和HPLC法使用最為普遍。

1 比色法

比色法有苯胺法、甲氧基苯胺法、三氯化銻（SbCl3）法、間苯三酚法等。目前中國普遍使用的方法是苯胺法。

1.1 苯胺法

國標苯胺法是國家飼料衛(wèi)生標準規(guī)定的方法，測定棉籽餅粕及其配合飼料中的游離棉酚含量均可采用此方法。苯胺法又可分為國標苯胺法（GB13086—91）、AOCS苯胺法（Ba7－58）（美國油化學家學會官方方法）和Smith苯胺比色法，這3種苯胺法分別以不同溶劑提取棉酚，用苯胺顯色后進行比色測定。國標苯胺法的測定原理是在3－氨基－1－丙醇存在下，用異丙醇與正己烷的混合溶劑（3∶2，V∶V）提取游離棉酚，加入苯胺與棉酚結(jié)合為苯胺棉酚，在最大吸收波長440 nm處進行比色測定。測定之前先配制異丙醇與正己烷的混合溶劑（3∶2，V∶V）和溶劑A（取異丙醇500 mL、正己烷混合溶劑、3－氨基－l－丙醇2 mL、冰乙酸8 mL和水50 mL，放入1 000 mL容量瓶中，再用異丙醇、正己烷混合溶劑定容）。具體操作步驟參照GB/T13086—1991。

AOCS Ba7－58法是美國油化學家學會（AOCS）官方方法，AOCS明確定義為凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物統(tǒng)稱為“游離棉酚”。該方法的原理是在適當?shù)脑囼灄l件下，用70%丙酮水溶液提取棉酚，棉酚與苯胺作用可生成黃色的二苯胺棉酚，分別測定苯胺棉酚和棉酚的吸光度，兩者之間的關系見式1。

式中：F為換算因子，在波長一定的條件下為常數(shù)；C為溶液中待測的游離棉酚的含量，單位mg；b、a分別為溶液中苯胺棉酚和棉酚的吸光度。

此式是根據(jù)朗伯－比爾定律A=￡bc推導而來。試驗先利用棉酚標樣（100%）配制一系列濃度的棉酚標液，該標液中游離棉酚的含量C是可計算得到，再通過測定標準棉酚的b－a值，利用式（1）求得換算因子F的平均值，然后測定待測溶液的棉酚和苯胺棉酚的吸光度a、b，得到b－a值，再將數(shù)據(jù)代入式（1），從而得到待測溶液中棉酚的含量，此法即為標準曲線法。

Smith苯胺比色法的原理與苯胺法相同。提取液為溶液A（乙醇715 mL，用水稀釋至1 000 mL，加冰乙酸0.2 mL及乙醚200 mL）。

游離棉酚及其衍生物的結(jié)構式中含有醛基和羥基，醛鄰位的酚羥基活性強，易與動物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸、磷脂等反應，造成動物機體功能紊亂，產(chǎn)生毒性作用。對于棉籽餅粕飼料的安全檢測應反映出樣品中有毒物質(zhì)的含量，所以檢測結(jié)果應包含棉酚及其衍生物。而苯胺法對棉酚的檢測就是利用醛鄰位的酚羥基與苯胺發(fā)生反應，生成的二苯胺棉酚在一定波長處有最大吸收峰，利用分光光度計測吸收值得到校正吸光度A，代入計算公式即得游離棉酚含量。該方法的檢測結(jié)果就包含棉酚和含有活性酚羥基的棉酚衍生物。所以用苯胺法檢測飼料中的棉酚含量更合適，這種方法比較可靠，但是操作步驟繁瑣、耗時，不適合大批量樣品檢測，并且苯胺毒性大，操作中要特別小心，長期接觸苯胺，很容易對操作人員造成傷害，苯胺不穩(wěn)定，易氧化由無色變?yōu)辄S色、棕色、直至紅棕色，從而使空白試驗吸收值升高，需重新進行蒸餾。周天兵等對AOCS苯胺法和國標苯胺法對常規(guī)棉粕的檢測結(jié)果進行了比較，結(jié)果表明，AOCS苯胺法用丙酮70%的提取棉酚及其衍生物較充分，測定值重復間差異小，結(jié)果穩(wěn)定，而國標苯胺法對棉酚及其衍生物的提取效果相對較差，結(jié)果不穩(wěn)定，重復性較差、建議可用AOCS苯胺法代替國標苯胺法檢測飼料中游離棉酚含量[3]。

1.2 三氯化銻法

三氯化銻法的原理是在氯仿溶液環(huán)境下，游離棉酚與SbCl3反應生成一種紅色絡合物，此絡合物在500～520 nm處有最大吸收峰，利用吸光度在一定范圍內(nèi)符合比爾定律進行比色測定[4]。但因SbCl3遇水易生成渾濁沉淀，操作需嚴格細致，稍不注意就會使比色液渾濁，導致分析失敗，且靈敏度較差。此法對試樣中棉酚的含量也有所限制，當樣品中的棉酚含量＞0.045%，會影響結(jié)果的準確性。

1.3 間苯三酚法

間苯三酚法是利用樣液中的棉酚和間苯三酚在弱酸性溶液中（＞6 moL鹽酸溶液）生成有色絡合物，絡合物的最大吸收峰在550 nm，顏色深淺與含量成正比而進行比色測定。該法簡便、靈敏度高，分析速度高于苯胺法，是目前常用的快速分析方法。原間苯三酚法的溶劑抽提系統(tǒng)采用丁酮一水恒沸液加少量苯胺（90+10+0.5）的混合溶液，因苯胺與丁酮一水恒沸液互溶性很差，極不穩(wěn)定，易產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象，造成提取液不穩(wěn)定，且制備恒沸溶液麻煩[5]。為克服這一缺陷，有學者改良了間苯三酚法，采用丙酮70%作為抽提液，同時縮短了抽提時間，靈敏度可達0.1 μg·25 mL－1（原方法的靈敏度為0.006 mg·25 mL－1），線性范圍0～160 μg·25 mL－1（原方法線性范圍是 0～100 μg·25 mL－1）。改良方法不僅克服了抽提液不穩(wěn)定的問題，也進一步提高了分析速度和檢測靈敏度，且線性范圍加寬。

2 紫外分光光度法

紫外分光光度法（UV）是食品行業(yè)檢測棉籽油中的游離棉酚含量的國標法，也可用于測定飼料中的棉酚含量。該法用70%丙酮溶液提取樣品中的棉酚，提取液在378 nm波長處有最大吸收峰，其吸收值與棉酚量在一定范圍內(nèi)成正比，與標準系列比較可得游離棉酚含量[6]。UV法所需儀器設備少、操作簡單易行，但由于是直接測定樣品溶液的吸光度，沒有參比溶液作對照，使得樣品中存在的干擾物質(zhì)沒有被分離，因此，UV法得到的結(jié)果一般偏高[7]。

3 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）的分離原理是當液體流動相所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發(fā)生力的作用，混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構上有差異，與固定相發(fā)生作用的大小也有差異，因此，在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的停留時間長短不同，從而按不同次序從固定相中流出，達到分離效果。待分離物質(zhì)即使結(jié)構非常相似，都具有不同的停留時間，只要選擇好合適的分離條件，就可以利用HPLC法將其成功分離出來，結(jié)構類似物之間不受干擾。HPLC法的理論價值是通過選用合適的分離條件分離出純棉酚，能比較真實地反應樣品中的棉酚水平。但是由于棉酚分子結(jié)構中含有6個羥基和兩個醛基，性質(zhì)很不穩(wěn)定，很容易發(fā)生反應產(chǎn)生結(jié)構相似的棉酚類似物。

目前關于HPLC法的報道較多，主要由于色譜柱、流動相和萃取劑的選擇的不同使得操作方法以及測定結(jié)果的穩(wěn)定性較差。張延坤等檢測結(jié)果表明，線性范圍為2～10 μg，最低檢出量為10 ng[8]。吳偉偉等試驗結(jié)果表明，棉酚的最低檢出濃度為0.94 mg·kg－1，平均回收率為96.23%～99.36%，RSD為3.24%～4.02%[9]。

4 原子吸收光譜法

目前用原子吸收光譜法（AAS）測游離棉酚的報道很少，主要是沒有明確的空心陰極燈或無極放電燈做電源，無法實現(xiàn)AAS測定。董仕林等報道，以鎳元素燈為光源用原子吸收儀測棉籽油中的游離棉酚含量，用丙酮70%萃取試樣中的游離棉酚，以4 mA電流、0.15 mm狹縫等條件測定游離棉酚，試驗結(jié)果與紫外分光光度法測得結(jié)果無顯著性差異（P＜0.05）[10]。

5 小 結(jié)

測定棉酚含量有多種方法，各種方法的測定結(jié)果都能反映出樣品間棉酚的相對水平，研究者應根據(jù)棉粕的加工用途和實際條件等具體情況選擇適合的分析方法。

[1]賀秀媛,李玉峰.棉籽餅粕飼料中游離棉酚測定方法的研究[J].中國畜牧雜志,2008,44（12）:60－62.

[2]張文舉.高效降解棉酚菌種的選育及棉籽餅粕生物發(fā)酵的研究[D].杭州:浙江大學,2006.

[3]周天兵,宋代軍,李愛科.兩種游離棉酚檢測方法對常規(guī)棉粕檢測的比較[J].畜牧與飼料科學,2011,32（2）:14－16.

[4]葉世柏.化學性食品中毒與檢驗[M].北京:北京大學出版社,1989.

[5]鄭清梅,溫茹淑,韓春艷.間苯三酚法快速測定棉粕中游離棉酚的方法研究[J].飼料工業(yè),2010,31（3）:42－44.

[6]黃永林,阮俊.棉籽中游離棉酚的含量測定[J].廣西植物,2001,21（4）:371－373.

[7]楊偉華,馮新愛,戚廷香,等.幾種測定游離棉酚方法的比較[J].中國棉花,1995,22（2）:13－14.

[8]張延坤,房玉水,鄧峰,等.用高效液相色譜法（HPLC）測定棉籽蛋白中的游離和總棉酚[J].營養(yǎng)學報,1995,17（4）:419－424.

[9]吳偉偉,許贛榮.HPLC法測定棉籽餅粕飼料中的游離棉酚[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,32（5）:105－107,118.

[10]董仕林,洪加敏.應用原子吸收法測定游離棉酚[J].中國公共衛(wèi)生,1993,9（8）:366－367.