天目山山胡椒不同部位內(nèi)生真菌組成及多樣性分析

吳曉菡，李文超，秦路平，①

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200026;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室，上海 200433)

天目山山胡椒不同部位內(nèi)生真菌組成及多樣性分析

吳曉菡1，2，李文超2，秦路平1，2，①

(1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200026;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室，上海 200433)

采用表面消毒法，從浙江天目山野生山胡椒〔Lindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume〕的莖、葉和樹皮中分離出內(nèi)生真菌，基于ITS序列分析進(jìn)行分類鑒定;并以內(nèi)生真菌的分離率、定殖率、分離頻率、多樣性指數(shù)(H')及相似性系數(shù)為指標(biāo)，分析了山胡椒內(nèi)生真菌的菌群組成及多樣性。結(jié)果顯示:在26株山胡椒樣株的728塊組織塊中共分離得到328株內(nèi)生真菌(莖、葉和樹皮中分別有161、40和127株);共鑒定出44個(gè)分類單元(莖、葉和樹皮中各有19、18和28個(gè))，其中25個(gè)分類單元鑒定到種、17個(gè)鑒定到屬、2個(gè)鑒定到科，ITS序列的GenBank登錄號(hào)從JF502420至JF502462。在44個(gè)分類單元中，有40個(gè)分類單元屬于子囊菌(310株)，存在于山胡椒的各個(gè)部位;僅有4個(gè)分類單元屬于擔(dān)子菌(18株)，且僅存在于莖和樹皮中。山胡椒莖、樹皮和葉中內(nèi)生真菌的定殖率分別為65%、60%和15%，分離率分別為0.77、0.61和0.19;葉和樹皮中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)均為2.63，遠(yuǎn)大于莖(H'= 1.83)。山胡椒內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬為Phomopsis、Paraconiothyrium、Phoma和Colletotrichum，大量存在于葉、莖和樹皮中。山胡椒莖與樹皮、莖與葉及葉與樹皮間內(nèi)生真菌的相似性系數(shù)分別為0.27、0.19和0.18，顯示樹皮和葉之間以及樹皮和莖之間內(nèi)生真菌的組成極不相似。研究結(jié)果表明:山胡椒體內(nèi)存在大量的內(nèi)生真菌，其莖、葉和樹皮的內(nèi)生真菌菌群組成具有一定程度的多樣性和差異性，且內(nèi)生真菌的分布具有組織特異性。

山胡椒;內(nèi)生真菌;組成;多樣性;ITS序列分析;相似性

山胡椒〔Lindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume〕又名牛筋條、牛筋樹、野胡椒、假死柴等，是樟科(Lauraceae)山胡椒屬(LinderaThunb.)灌木或者小喬木，廣泛分布于中國黃河以南地區(qū)。山胡椒入藥的記載始于唐代的《新修本草》，稱其“葉辛、大熱、無毒”，主治“心腹痛、中冷破滯”［1－2］。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究證明:山胡椒葉精油對(duì)雞胚具有抗流感病毒作用，并且對(duì)常見的14種細(xì)菌有不同程度的抗菌作用［3－4］;山胡椒根用水煎服能散瘀通絡(luò)，治療跌打損傷、心腹冷痛;民間用其葉泡茶服用，用于預(yù)防感冒、中暑，外敷可治療瘡癰腫毒［5］。

內(nèi)生真菌(endophytic fungus)是指在其生活史中某一階段生活在植物組織內(nèi)、并且沒有引起植物組織明顯病害癥狀的真菌，包括那些在其生活史中的某一階段營表生生活的腐生真菌和對(duì)宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原真菌和菌根菌［6］。

植物內(nèi)生真菌的數(shù)量巨大，具有產(chǎn)生新天然產(chǎn)物的能力，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，因而植物的內(nèi)生真菌是一個(gè)巨大的資源寶庫，是天然產(chǎn)物的重要來源［7］。目前對(duì)植物內(nèi)生真菌的鑒定主要采用以孢子形態(tài)特征為主要依據(jù)的傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法，但實(shí)際上總有一些菌株在人工培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生孢子，這類不產(chǎn)孢菌株的比例從4.5%到54%［8－15］，采用傳統(tǒng)的方法無法確定這些菌株的分類地位。因此，作者擬采用分子生物學(xué)方法、通過內(nèi)生真菌ITS序列的比較對(duì)菌株加以鑒定，以期反映它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并為不產(chǎn)孢菌株的鑒定提供分子生物學(xué)依據(jù)。

目前，國內(nèi)對(duì)山胡椒的研究主要集中在其化學(xué)成分組成和藥理作用等方面［1－5，16］，尚未見有關(guān)山胡椒內(nèi)生真菌的研究報(bào)道。為了研究山胡椒內(nèi)生真菌的多樣性，作者借助于ITS序列對(duì)產(chǎn)自浙江天目山的野生山胡椒體內(nèi)的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，并分析其種類組成，為山胡椒藥用成分與內(nèi)生真菌關(guān)系的研究以及植物內(nèi)生真菌的分離鑒定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試山胡椒植物樣品于2009年11月采自浙江臨安天目山，選擇26株健康植株，采集葉片、枝條和樹皮供試。所采樣品由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室秦路平教授鑒定。

試劑:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);CTAB緩沖液(pH8.0);TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs Mix、MgCl2、引物ITS4和ITS5等，均購自上海生工生物工程有限公司。

儀器:SW－CJ－1D型單人凈化工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán));隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱和THZ－82A臺(tái)式恒溫振蕩器(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);5333型PCR儀(德國Eppendorf);EPS 300電泳系統(tǒng)和Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);飛鴿TGL－16G態(tài)勢(shì)超速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌分離方法將新鮮健康的山胡椒的葉、枝條和樹皮用流水洗凈后表面消毒，方法如下:在超凈工作臺(tái)中用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇漂洗1 min，用體積分?jǐn)?shù)3%NaClO溶液漂洗3 min，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇漂洗30 s，無菌水沖洗4次。用無菌濾紙吸干水分，葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小片、枝條切成0.5 cm長的小段、樹皮切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，每個(gè)培養(yǎng)皿接種4塊相同類型組織塊，每個(gè)植株每個(gè)部位接種2個(gè)培養(yǎng)皿。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～30 d，待培養(yǎng)基上可觀察到從組織塊內(nèi)部向周圍長出菌絲時(shí)，采用尖端菌絲挑取法將真菌轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待純化后轉(zhuǎn)移到PDA斜面試管中，編號(hào)備用［17］。分離過程中設(shè)置對(duì)照組，將經(jīng)表面消毒的同類組織塊在空白培養(yǎng)基上滾動(dòng)，使組織塊的每個(gè)表面都接觸到培養(yǎng)基，按前述方法同期培養(yǎng)，對(duì)照培養(yǎng)基上未長出菌落，說明表面消毒徹底。

1.2.2 DNA提取和ITS序列PCR擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)［18］采用CTAB法提取DNA。分別以通用引物ITS5(5'－GGAACTAAAAGTCGTAACAAGG－3')和ITS4(5'－TCCTCCGCTI'ATI'GATATGC－3')為上、下游引物進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包含:20 mmol·L－1Tris－HCl(pH 8.4)、20 mmol·L－1KCl、10 mmol·L－1(NH4)2SO4、2 mmol·L－1MgSO4、200 μmol·L－1dNTPs Mix、15 pmol ITS5、15 pmol ITS4、100 ng模板DNA和2.5 UTaqDNA聚合酶，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性40 s，52℃退火50 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸10 min。

采用含40 mmol·L－1Tris和1 mmol·L－1EDTA (pH 8.0)1×TAE的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，點(diǎn)樣量4 μL;于75 V電泳40 min，然后用0.5 μg·mL－1溴化乙啶染色10 min，在紫外燈下檢測(cè)電泳結(jié)果。測(cè)序由上海申速生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用BLAST軟件將獲得的ITS序列與GenBank中已登錄的序列進(jìn)行對(duì)比并下載同源序列。通過Clustal X1.81程序進(jìn)行序列間的匹配排序［19］，并用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹，通過置信度評(píng)估，確定菌株的親緣關(guān)系及分類地位。

采用分離率(isolation rate)、定殖率(colonization rate)、分離頻率(relative frequency)、多樣性指數(shù)(biodiversity index，H')以及相似性系數(shù)(similarity coefficient)等5個(gè)指標(biāo)對(duì)不同樣株及不同部位內(nèi)生真菌的侵染狀況、多樣性及相似度進(jìn)行比較。

分離率是指得到的內(nèi)生真菌菌株總數(shù)與供試植物組織塊總數(shù)的比值。該指標(biāo)可以度量在一個(gè)特定的植物組織樣品中內(nèi)生真菌的豐度以及植物組織樣品中多重侵染的頻率。

定殖率是指被內(nèi)生真菌侵染的組織塊數(shù)占全部組織塊數(shù)的百分率［8］，該指標(biāo)能夠反映不同植物或者同一植物不同組織受到內(nèi)生真菌侵染的程度。

分離頻率是指樣本中分離到的某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占總菌株數(shù)的百分率，該指標(biāo)能反映某種內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)的豐富度。

根據(jù)Shannon－Wiener指數(shù)公式計(jì)算多樣性指數(shù):H'=Pi×lnPi。式中:k為宿主體內(nèi)內(nèi)生真菌種類的總數(shù);Pi是指某種內(nèi)生真菌的菌株數(shù)占全部內(nèi)生真菌菌株總數(shù)的百分率。多樣性指數(shù)可反映內(nèi)生真菌的物種數(shù)量及其分布的均勻度。

相似性系數(shù)根據(jù)Jaccard公式［20］進(jìn)行計(jì)算:J=j/(a+b－j)，其中j為兩部位共有的內(nèi)生真菌種類數(shù);a、b是兩部位各自的內(nèi)生真菌種類數(shù)。根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理，當(dāng)J為0.00～0.25時(shí)為極不相似;J為0.25～0.50時(shí)為中等不相似;J為0.50～0.75時(shí)為中等程度相似;J為0.75～1.00時(shí)為極為相似。

2 結(jié)果和分析

2.1 山胡椒不同部位內(nèi)生真菌分離率和定殖率及多樣性比較

山胡椒不同部位內(nèi)生真菌的分離率、定殖率及多樣性指數(shù)見表1。山胡椒莖中內(nèi)生真菌的定殖率最高(65%)、樹皮中略低(60%)，而葉中最低(僅15%)。分離率的變化規(guī)律與定殖率一致，從高到低依次為莖(0.77)、樹皮(0.61)、葉(0.19)。與其他宿主中內(nèi)生真菌定殖率和分離率［21－23］相比，山胡椒葉中內(nèi)生真菌的定殖率和分離率偏低，而樹皮和莖中則與其他宿主相似。山胡椒葉和樹皮中內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)均為2.63，遠(yuǎn)高于莖(H'=1.83)。雖然樹皮和葉中內(nèi)生真菌總數(shù)比莖少，但因種類數(shù)比莖多，因而內(nèi)生真菌的多樣性指數(shù)高于莖。

表1 山胡椒不同部位內(nèi)生真菌的定殖率、分離率和多樣性指數(shù)(H')Table 1 The colonization rate，isolation rate and Shannon-Wiener biodiversity index(H')of endophytic fungi in different parts of Lindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume

2.2 山胡椒不同部位內(nèi)生真菌種類組成分析

在26株山胡椒樣株的728塊組織塊中共分離得到328株內(nèi)生真菌，鑒定到44個(gè)分類單元，GenBank登錄號(hào)從JF502420到JF502462。其中25個(gè)分類單元鑒定到種、17個(gè)鑒定到屬、2個(gè)鑒定到科(見表2)。

從山胡椒莖的木質(zhì)部中分離得到內(nèi)生真菌161株，占菌株總數(shù)的49.1%;包含19個(gè)分類單元，其中12個(gè)鑒定到種、7個(gè)鑒定到屬。從山胡椒葉中分離得到內(nèi)生真菌40株，占菌株總數(shù)的12.2%;包含18個(gè)分類單元，其中10個(gè)鑒定到種、7個(gè)鑒定到屬、1個(gè)鑒定到科。從山胡椒樹皮中分離得到內(nèi)生真菌127株，占菌株總數(shù)的38.7%;包含28個(gè)分類單元，其中15個(gè)鑒定到種、12鑒定到屬、1個(gè)鑒定到科。

表2 山胡椒不同部位內(nèi)生真菌的分離頻率Table 2 The relative frequency of endophytic fungi in different parts of Lindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume

在44個(gè)分類單元中，有40個(gè)分類單元屬于子囊菌，占90.9%;其中22個(gè)鑒定到種、16個(gè)鑒定到屬、2個(gè)鑒定到科;子囊菌共計(jì)310株，占菌株總數(shù)的94.51%，存在于山胡椒的各個(gè)部位。有4個(gè)分類單元屬于擔(dān)子菌，占9.1%;這4個(gè)分類單元是Irpex lacteus，Peniophorasp.，Schizophyllumcommune和Trametes versicolor;擔(dān)子菌的比例很小，僅有18株，占菌株總數(shù)的5.49%，僅存在于山胡椒的莖和樹皮中。

2.3 山胡椒不同部位內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)類群分析

Phomopsissp.在山胡椒各部位中廣泛存在，在莖、葉和樹皮中的分離頻率都較高。另外2個(gè)同目的屬是Diaporthe和Dicarpella，其中，Dicarpella dryina在葉中僅1株;而屬于Diaporthesp.的4個(gè)分類單元均僅鑒定到屬，并且在葉和樹皮中分別僅有2株和11株，分離頻率為3.96%。

從山胡椒中獲得的Paraconiothyrium屬真菌有4個(gè)分類單元，其中，Paraconiothyriumsp.1和sp.2在莖、葉和樹皮中均有分布，分離頻率相對(duì)較高，分別達(dá)到6.10%和3.05%;Paraconiothyriumsp.3僅從莖和樹皮中各分離到1株;而同屬的P.brasiliense只存在于莖中。

Colletotrichum crassipes也是山胡椒內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)類群，共獲得21株，在莖、葉和樹皮中分別有12株、3株和6株，分離頻率為6.40%;另外有3個(gè)分類單元屬于同屬的C.coffeanum，存在于莖和葉中，共5株，分離頻率僅為1.52%。

山胡椒體內(nèi)內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬還有Phoma。其中，Phoma bellidis共有10株，分離頻率為3.05%，在莖、葉和樹皮中分別有5株、2株和3株;Phoma rhei共有9株，分離頻率為2.74%，在葉和樹皮中分別有2株和7株;Phoma senecionis僅從莖中分離得到2株;Phomasp.僅從樹皮中分離得到2株。

除上述4屬外，山胡椒莖、葉和樹皮中常見的內(nèi)生真菌還有Peziculasp.、Helminthosporium velutinum、Cladosporium cladosporioides、Gibberellasp.、Fusarium solani和Plesporalessp.2。Peziculasp.只分布在葉(1株)和樹皮(11株)中，該菌的主要侵染部位是樹皮。Helminthosporium velutinum的分離頻率為2.43%，共分離得到8株，莖和葉中各有4株。Cladosporium cladosporioides共有7株，其中6株存在于樹皮中，莖中僅1株，分離頻率為2.13%。Gibberellasp.只鑒定到屬的水平，僅分離到6株，分離頻率為1.83%，但在莖、葉和樹皮中均有分布;該屬真菌能夠產(chǎn)生赤霉素，可以促進(jìn)植物的生長，也曾在可可(Theobroma cacaoL.)和南方紅豆杉〔Taxus chinensisvar.mairei(Lemée et H.Léveillé)W.C.Cheng et L.K.Fu〕中分離得到。Fusarium solani在莖中有4株，在樹皮中有2株。Plesporalessp.2有5株、Plesporalessp.1有3株，這2個(gè)分類單元僅存在于樹皮中。

2.4 山胡椒不同部位間內(nèi)生真菌的相似性分析

在內(nèi)生真菌的44個(gè)分類單元中，僅有6個(gè)分類單元在山胡椒3個(gè)部位中均有分布，分別是Phomopsissp.、Paraconiothyriumsp.1和sp.2、Colletotrichum crassipe、Gibberellasp.和Phoma bellidis，占分類單元總數(shù)的13.6%;共有207個(gè)菌株，占菌株總數(shù)的63.1%。其中，有27個(gè)分類單元僅在1個(gè)部位有分布，占分類單元總數(shù)的63.6%，共計(jì)61株，占菌株總數(shù)的18.6%。

山胡椒莖、葉和樹皮中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬是Phomopsis、Paraconiothyrium、Phoma和Colletotrichum，在山胡椒各部位均有分布，共226株，占菌株總數(shù)的68.9%。從相似性系數(shù)上看，莖與樹皮間內(nèi)生真菌的相似度值最高(0.27)，莖與葉間、葉與樹皮間內(nèi)生真菌的相似度值分別為0.19和0.18。根據(jù)Jaccard相似性系數(shù)原理，樹皮和葉之間以及樹皮和莖之間內(nèi)生真菌的組成極為不相似，而樹皮和莖之間內(nèi)生真菌組成的不相似程度為中等。

3 討論

內(nèi)生真菌存在較為廣泛，目前所發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌種類主要為子囊菌及其無性型，同時(shí)也有少量的擔(dān)子菌和接合菌［24－28］。從山胡椒莖、葉和樹皮3個(gè)部位分離得到的內(nèi)生真菌經(jīng)ITS序列驗(yàn)證大部分是子囊菌，該結(jié)果和前人的研究結(jié)果基本一致。

山胡椒莖、葉和樹皮中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬為Phomopsis、Paraconiothyrium、Colletotrichum和Phoma。Phomopsis屬的真菌大部分是植物病原菌，能引起植物組織病變，其中的一些種類是常見的熱帶植物病原菌，在冬青櫟(Quercus ilexL.)、蒲葵〔Livistona chinensis(Jacq.)R.Br.ex Mart.〕、印楝樹(Azadirachta indicaA.Juss.)和肖菝葜(Heterosmilax japonicaKunth)等多種植物的內(nèi)生真菌中均分離得到該屬真菌［29－32］。Paraconiothyrium屬真菌是2004年分離獲得的，是Paraphaeosphaeria的無性型［33］，該屬真菌是月桂(Laurus nobilisL.)內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群［34］;從元寶楓(Acer truncatumBunge)中分離得到的該屬真菌P.brasiliense能夠產(chǎn)生pinthunamide和新三萜化合物brasilamides A-D［35］。Colletotrichum屬真菌也是一類常見的病原菌，在可可、積雪草〔Centella asiatica(L.) Urban〕、蒲葵和馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)等多種植物的內(nèi)生真菌中均發(fā)現(xiàn)有該屬真菌［36－38］。Phoma屬真菌在山胡椒各部位均有分布，在積雪草和棕櫚〔Trachycarpus fortunei(Hook.)H.Wendl.〕等多種植物的內(nèi)生真菌中也曾分離獲得［39］。Diaporthe屬真菌是常見內(nèi)生真菌，在可可和茶〔Camellia sinensis(L.) O.Kuntze〕中都曾有發(fā)現(xiàn)。鐮刀菌(Fusariumsp.)是一類分布廣泛的真菌，是防治較為困難的植物病原菌之一，存在于山胡椒體內(nèi)的F.solani也曾有學(xué)者從南方紅豆杉中獲得1株并能夠產(chǎn)生紫杉醇［40］。

從山胡椒體內(nèi)獲得的內(nèi)生真菌大部分是植物病原菌，會(huì)引發(fā)植物的各種病變，但是供試樣株均為健康植株，沒有出現(xiàn)病害感染的癥狀，也即沒有為病原菌提供生長環(huán)境;加之表面消毒比較徹底，也可以排除植物的表生菌和腐生菌，因而從健康宿主分離到病原菌的原因與宿主本身的特性有關(guān)。山胡椒體內(nèi)含有具有抗菌作用的化學(xué)成分［3－5］，這些化學(xué)成分抑制了病原菌對(duì)植株的侵害或者抑制了有害癥狀的表現(xiàn)，使宿主與真菌的相互作用處于平衡狀態(tài)，能夠使真菌在宿主體內(nèi)存活但不表現(xiàn)出有害癥狀。因此，從山胡椒體內(nèi)得到的這些真菌是內(nèi)生的且不引起植物病害，這與內(nèi)生真菌的定義是相符的。在本研究過程中分離獲得的內(nèi)生真菌大都作為植物內(nèi)生真菌被廣泛報(bào)道，可能與實(shí)驗(yàn)過程中運(yùn)用的分離培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基有關(guān)，而采用不同的培養(yǎng)基內(nèi)生真菌的分離效果是不同的［41］，不同真菌各自的最適培養(yǎng)基也不同，因此，可采用不同的培養(yǎng)基或培養(yǎng)基組合進(jìn)行進(jìn)一步分離，以獲得更多的內(nèi)生真菌菌株。

研究結(jié)果表明:在山胡椒體內(nèi)內(nèi)生真菌的分布部位均有差異性和專一性，部分真菌具有組織偏好性。莖中內(nèi)生真菌的菌株數(shù)多但種類比較少，而樹皮中內(nèi)生真菌的種類最多，葉中內(nèi)生真菌的種類數(shù)介于前二者之間，各部位間內(nèi)生真菌的相似性很低。其原因除與各部位的化學(xué)組成有差異、造成內(nèi)環(huán)境的差異而影響內(nèi)生真菌菌群組成外，可能與各部位的形態(tài)和生態(tài)特征有關(guān)。樹皮的外表層比較薄，與外界環(huán)境接觸面積大，而且腐爛較多且易被侵染，腐生菌和表生菌較多，因此，真菌侵染樹皮的幾率比較大。而山胡椒為半常綠灌木，葉片每年更新1次，莖部的內(nèi)生真菌會(huì)侵染新葉，且葉片表面積也較大，增加了真菌侵染的幾率。莖的表面積和體積均較小，為內(nèi)生真菌提供的生存空間小，而且冬季溫度低，數(shù)量多的真菌存活幾率大，加之莖的內(nèi)環(huán)境比較穩(wěn)定，所以雖然內(nèi)生真菌種類少但菌株數(shù)量多。影響植物內(nèi)生真菌分布的因素和作用機(jī)制是多方面和復(fù)雜的，因此，有關(guān)山胡椒內(nèi)生真菌的分布特征還需要更全面的研究。

李海波［42］等認(rèn)為:真菌的ITS序列具有種內(nèi)相對(duì)一致、種間差異比較明顯的特點(diǎn)，使真菌ITS序列不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。因此，作者采用分子生物學(xué)方法、通過ITS序列的比較對(duì)山胡椒不同部位內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，該方法具有方便、快捷且信息量大的特點(diǎn)，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法不能鑒定不產(chǎn)孢菌株的缺憾，但鑒定方法較為單一，有些分類單元只能鑒定到屬或科水平，因而，對(duì)其中的有些分類單元還有待結(jié)合真菌的形態(tài)特征進(jìn)行進(jìn)一步的分類鑒定。

從植物的內(nèi)生真菌中能分離到與宿主相同或相似的活性成分，且藥用植物的內(nèi)生真菌也具有抗菌或者抗腫瘤的活性［40，43－45］，因而，山胡椒不同部位內(nèi)生真菌是否也有此特性則有待深入探討。

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(責(zé)任編輯:惠紅)

Analyses on composition and diversity of endophytic fungi in different parts of Lindera glauca from Tianmu Mountain

WU Xiao-han1，2，LI Wen-chao2，QIN Lu-ping1，2，①(1.School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai 200026，China;2.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military University，Shanghai 200433，China)，J.Plant Resour.＆Environ.2012，21(2):107－113

By the surface sterilization method，endophytic fungi were isolated from stem，leaf and bark of wildLindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume from Tiammu Mountain of Zhejiang Province，and were identified and classified according to ITS sequence analysis result.Taking isolation rate(IR)，colonization rate(CR)，relative frequency(RF)，Shannon-Wiener biodiversity index(H')and similarity coefficient(Cs)as indexes，the composition and diversity of endophytic fungal community were analyzed.The results show that 328 strains of endophytic fungi(161 strains in stem，40 strains in leaf and 127 strains in bark)are obtained from 728 tissues of 26 individuals ofL.glauca.44 taxa are identified(19 taxa in stem，18 taxa in leaf and 28 taxa in bark)，in which，25 taxa are identified to species，17 taxa to genus and 2 taxa to family.The accession numbers of their ITS sequences in GenBank are from JF502420 to JF502462.In all of 44 taxa，40 taxa belong to Ascomycota(310 strains)which exist in all parts ofL.glauca，and 4 taxa belong to Basiodiomycota(18 strains)which only exist in stem and bark ofL.glauca.Endophytic fungal CR in stem，bark and leaf ofL.glaucais 65%，60%and 15%，IR is 0.77，0.61 and 0.19，respectively.Endophytic fungalH'in leaf and bark both is 2.63，which is obviously higher than that in stem(H'=1.83).The dominant genera of endophytic fungi inL.glaucaarePhomopsis，Paraconiothyrium，PhomaandColletotrichum，most of them exist in leaf，stem and bark.Cs value of endophytic fungi between stem and bark，stem and leaf，leaf and bark is 0.27，0.19 and 0.18，respectively，which shows the composition of endophytic fungi between bark and leaf or bark and stem is not extremely similar.It is indicated that there are a lot of endophytic fungi inL.glauca，the composition of endophytic fungal community in stem，leaf and bark has a certain diversity and difference，and the distribution of endophytic fungi has the tissue specificity.

Lindera glauca(Sieb.et Zucc.)Blume;endophytic fungus;composition;diversity;ITS sequence analysis;similarity

book=2012,ebook=55

Q949.32;Q948.12+2.3

A

1674－7895(2012)02－0107－07

2011－05－09

吳曉菡(1986—)，女，河南南陽人，碩士研究生，研究方向?yàn)橘Y源植物化學(xué)。

①通信作者E-mail:qinsmmu@126.com