張紅珠 張 琪 張翠萍 孫向紅 王輝明

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科(266003)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是一種胃癌癌前狀態(tài)，幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染與CAG和胃癌，尤其是腸型胃癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］，預(yù)防和阻止CAG向胃癌進(jìn)展是一個(gè)重要臨床問(wèn)題。CAG經(jīng)腸化生、異型增生向胃癌演變的過(guò)程中有多種因素參與，包括癌基因激活、抑癌基因失活、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子調(diào)控異常、免疫調(diào)節(jié)異常等。本實(shí)驗(yàn)以Hp相關(guān)CAG大鼠模型為研究對(duì)象，通過(guò)觀察黏膜保護(hù)劑替普瑞酮對(duì)模型動(dòng)物CAG發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中腫瘤抑制基因p16和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，探討替普瑞酮對(duì)CAG的防治作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株和藥物

健康雄性清潔級(jí) Wistar大鼠70只，體質(zhì)量150～200 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)監(jiān)中心提供(許可證號(hào):SCXK魯20080002)。Hp SS1菌株由江蘇省人民醫(yī)院潘曉林博士惠贈(zèng)。替普瑞酮［衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司，商品名:施維舒，50 mg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字:J20030052，批號(hào):101105A］、阿莫西林(山東淄博新達(dá)制藥有限公司，商品名:新達(dá)貝寧，250 mg/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字:H37020470，批號(hào):110840)、吲哚美辛(臨汾奇林藥業(yè)有限公司，25 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字:H14020549，批號(hào):1010031)分別與蒸餾水以 5∶1、17.5∶1、0.9∶1 的質(zhì)量比例配制成溶液。

二、方法

1.動(dòng)物分組和CAG模型制備:70只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=20)、CAG模型組(n=25)和替普瑞酮干預(yù)組(n=25)。Hp懸液和CAG模型的制備參考既往文獻(xiàn)并加以改進(jìn)［2～4］。CAG模型組和替普瑞酮干預(yù)組先序貫予阿莫西林175 mg/kg(1周)和吲哚美辛9 mg/kg(5 d)灌胃預(yù)處理，再予Hp懸液(1×1012cfu/L)灌胃，每次1.5 mL，隔日一次，共6次。灌胃前后分別禁食12 h和4 h。間隔2周后以60%(v/v)乙醇溶液 與20 g/L水楊酸鈉溶液按50∶1的體積比例配制灌胃，每次1 ml/100 g，每日一次，共26周。正常對(duì)照組僅以0.9%NaCl溶液灌胃，每次1 ml/100 g，每日一次，共26周。除規(guī)定禁食時(shí)間外，所有大鼠均自由進(jìn)食、飲水。

2.替普瑞酮干預(yù):替普瑞酮干預(yù)組于乙醇-水楊酸鈉溶液灌胃后5 h以50 mg/kg替普瑞酮灌胃，兩次灌胃間禁食、禁水，共干預(yù)26周。

3.一般情況觀察:實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察并記錄各組大鼠一般情況，每周測(cè)量體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整藥物劑量。

4.標(biāo)本獲取和組織病理學(xué)檢查:最后一次灌胃結(jié)束后禁食24 h，頸椎離斷法處死大鼠。剪開(kāi)腹腔，取出全胃，沿大彎側(cè)剪開(kāi)，以0.9%NaCl溶液沖洗干凈，觀察胃黏膜大體形態(tài)(黏膜色澤、光滑度、有無(wú)損傷以及胃體、胃竇厚度)。標(biāo)本以4%甲醛溶液固定24 h，沿大彎側(cè)橫向取材，包括胃體和胃竇，寬約4 mm，脫水，石蠟包埋，切片，行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察胃黏膜組織學(xué)表現(xiàn)。

5.免疫組化染色:采用非生物素即用型二步法。鼠p16單克隆抗體、小鼠超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑、兔TGF-β1多克隆抗體、兔二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。具體操作步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)。

p16、TGF-β1免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色或棕黑色。于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取15個(gè)高倍視野(×400)，每視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取均值。陽(yáng)性細(xì)胞百分率≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

正常對(duì)照組大鼠皮毛白亮光滑，兩眼有神，活動(dòng)敏捷，食量大，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體質(zhì)量呈上升趨勢(shì)，糞便呈黑色顆粒狀，無(wú)便溏現(xiàn)象。CAG模型組大鼠皮毛發(fā)黃，無(wú)光澤，兩眼無(wú)神，動(dòng)作遲緩，拱背，聚集成堆，食量小，起初體質(zhì)量緩慢上升，第15周后逐漸下降，有便溏現(xiàn)象，四肢和尾部略蒼白。替普瑞酮干預(yù)組大鼠皮毛略發(fā)黃，兩眼有神，活動(dòng)較敏捷，食量可，體質(zhì)量明顯高于同時(shí)點(diǎn)CAG模型組，接近正常對(duì)照組，起初有便溏現(xiàn)象，藥物干預(yù)21 d后癥狀逐漸緩解。CAG模型組第3周、第12周、第15周各有1只大鼠死亡，死亡原因考慮分別與灌胃后嗆咳、窒息、肺部感染可能和腸道巨大膿腫所致的腸梗阻有關(guān);替普瑞酮干預(yù)組第2周有2只大鼠死亡，死因?yàn)楣辔负髥芸取⒅舷?。圖1為三組大鼠實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化情況。

圖1 各組大鼠體質(zhì)量變化

二、組織病理學(xué)表現(xiàn)

1.肉眼觀察:正常對(duì)照組胃黏膜呈紅色，表面光滑，無(wú)顆粒感，厚度約2 mm。CAG模型組大鼠多有胃腸動(dòng)力障礙，禁食24 h后胃內(nèi)仍有殘留食物;胃黏膜以白色為主，多數(shù)出現(xiàn)糜爛和陳舊性出血點(diǎn)，以胃竇部為主，黏膜變薄。替普瑞酮干預(yù)組胃黏膜紅潤(rùn)光滑，無(wú)出血、糜爛，胃竇部黏膜較正常對(duì)照組略變薄(見(jiàn)圖2)。

2.光學(xué)顯微鏡觀察:正常對(duì)照組胃黏膜腺體排列規(guī)整，偶可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。CAG模型組胃黏膜變薄，腺體間隙較大，排列不規(guī)整，腺體出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞數(shù)目減少。替普瑞酮干預(yù)組胃黏膜較CAG模型組增厚，腺體排列規(guī)整，腺體數(shù)目較CAG模型組增多(見(jiàn)圖3)。

三、胃黏膜 p16、TGF-β1 蛋白表達(dá)

p16陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核(見(jiàn)圖4)。正常對(duì)照組、CAG模型組、替普瑞酮干預(yù)組胃黏膜p16陽(yáng)性表達(dá)率分別為 95.0%(19/20)、36.4%(8/22)、73.9%(17/23)，正常對(duì)照組和替普瑞酮干預(yù)組顯著高于 CAG 模型組(χ2=15.688，P=0.000;χ2=6.421，P=0.011)，但正常對(duì)照組與替普瑞酮干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.114，P=0.146)。

TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(見(jiàn)圖4)。正常組對(duì)照、CAG模型組、替普瑞酮干預(yù)組胃黏膜TGF-β1 陽(yáng)性表達(dá)率分別為 10.0%(2/20)、81.8%(18/22)、30.4%(7/23)，正常對(duì)照組和替普瑞酮干預(yù)組顯著低于CAG 模型組(χ2=21.663，P=0.000;χ2=12.024，P=0.001)，但正常對(duì)照組與替普瑞酮干預(yù)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.699，P=0.100)。

圖2 各組大鼠胃黏膜大體形態(tài)

圖3 各組大鼠胃黏膜組織學(xué)表現(xiàn)(HE染色)

圖4 各組大鼠胃黏膜p16、TGF-β1蛋白表達(dá)(免疫組化染色，×200)

討 論

替普瑞酮是一種具備良好理化特性的黏膜保護(hù)劑，可促進(jìn)胃黏膜、胃黏液中主要再生防御因子、高分子糖蛋白、磷脂的合成和分泌，提高胃黏液中的碳酸氫鹽含量，改善受損胃黏膜增生區(qū)細(xì)胞的增殖能力，增加胃黏膜中前列腺素的生物合成，改善胃黏膜血流，對(duì)急、慢性胃炎和胃潰瘍具有良好療效。研究證實(shí)替普瑞酮可有效預(yù)防非甾體消炎藥(NSAIDs)相關(guān)胃黏膜損傷［5，6］;并可通過(guò)促進(jìn)胃黏膜熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)參與胃黏膜修復(fù)［7］。有臨床治療中，替普瑞酮能明顯改善CAG患者的臨床、內(nèi)鏡和組織學(xué)表現(xiàn)，患者胃黏膜炎癥、活動(dòng)性、腺體數(shù)目減少、腸化生和異型增生評(píng)分均較治療前顯著降低［8］;還能增加慢性非萎縮性胃炎患者的胃黏膜氨基己糖(反映黏蛋白分泌情況)含量，并有效抑制Hp［9］。本研究顯示替普瑞酮干預(yù)可明顯改善CAG模型大鼠的一般情況以及胃黏膜大體形態(tài)和組織學(xué)表現(xiàn)，模型大鼠胃黏膜增厚，腺體數(shù)目增多，無(wú)出血、糜爛，表明其能修復(fù)胃黏膜損傷，且對(duì)胃黏膜萎縮有部分逆轉(zhuǎn)作用。

p16為公認(rèn)的腫瘤抑制基因，定位于人類(lèi)染色體9p21，多數(shù)惡性腫瘤存在p16基因缺失或突變。p16基因編碼蛋白是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，可與cyclin D競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4/6，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而對(duì)有絲分裂進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，發(fā)揮抑癌作用。p16基因缺失、突變或啟動(dòng)子區(qū)甲基化所致的基因功能缺失及其蛋白表達(dá)異常參與了惡性腫瘤的發(fā)生?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)p16基因改變，尤其是基因缺失與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)［10，11］。既往研究［12～14］顯示，在大鼠CAG的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，從正常胃黏膜至萎縮、腸化生和異型增生，p16蛋白表達(dá)逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)中CAG模型大鼠胃黏膜p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于正常大鼠，而接受替普瑞酮干預(yù)的模型大鼠p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較未接受干預(yù)者顯著增高，與正常大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)p16基因功能缺失和蛋白表達(dá)異常參與了CAG的發(fā)生、發(fā)展，而替普瑞酮干預(yù)可通過(guò)恢復(fù)p16的表達(dá)和功能阻止CAG進(jìn)一步發(fā)展。

TGF-β是一類(lèi)具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子家族，哺乳動(dòng)物中有 TGF-β1、β2、β3三種亞型表達(dá)，其中以TGF-β1含量最高，具有代表性。TGF-β1通過(guò)與細(xì)胞膜上的TGF-β受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和形態(tài)形成，在血管生成、損傷修復(fù)、免疫抑制、細(xì)胞外基質(zhì)形成、纖維化和腫瘤發(fā)生中亦發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1可促進(jìn)初始T細(xì)胞向具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化，通過(guò)抑制宿主免疫系統(tǒng)，使腫瘤逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移［15，16］。研究發(fā)現(xiàn)從正常胃黏膜、慢性非萎縮性胃炎、CAG、腸化生/異型增生至胃癌，胃黏膜TGF-β1蛋白表達(dá)隨黏膜病變的加重而逐漸增高［15，17］，同時(shí)機(jī)體細(xì)胞免疫功能逐漸降低［15］。本實(shí)驗(yàn)中CAG模型大鼠胃黏膜TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常大鼠，與既往研究結(jié)果一致，證實(shí)TGF-β1參與了正常胃黏膜由胃癌癌前狀態(tài)逐步進(jìn)展至胃癌的演變過(guò)程;而接受替普瑞酮干預(yù)的模型大鼠TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較未接受干預(yù)者顯著降低，與正常大鼠相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明普瑞酮干預(yù)可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1表達(dá)抑制CAG的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，在大鼠正常胃黏膜向CAG轉(zhuǎn)變的過(guò)程中，胃黏膜 p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈下降趨勢(shì)，TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率呈上升趨勢(shì)。造模期間給予替普瑞酮干預(yù)能修復(fù)胃黏膜損傷，部分逆轉(zhuǎn)胃黏膜萎縮，阻止CAG的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能部分與恢復(fù)p16表達(dá)和功能以及下調(diào)TGF-β1表達(dá)有關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)為應(yīng)用黏膜保護(hù)劑替普瑞酮治療CAG并阻止其癌變提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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