李竹石，林 華，楊 健，楊會強，曾獻武，趙 宇，劉 俐，劉莉娜，康 莊，俞永新，李玉華*

(1.中國生物技術集團公司成都生物制品研究所有限責任公司，四川成都610023;2.中國食品藥品檢定研究院，北京100050)

登革病毒(Dengue virus，DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬，分為1、2、3和4這4個不同的血清型，是一類經(jīng)蚊媒傳播的單股正鏈RNA病毒。登革病毒可引起登革熱(Dengue fever，DF)及更嚴重的登革出血熱(Dengue hemorrhagic fever，DHF)與登革休克綜合征(Dengue shock syndrome，DSS)，目前尚無特異性藥物與疫苗問世，因此已成為全球尤其是熱帶與亞熱帶地區(qū)人群健康的主要威脅之一。根據(jù)WHO發(fā)布的信息，全球每年約有1億登革熱患者，死亡達2.5萬人。近年來，登革熱在我國的發(fā)病率亦呈顯著上升趨勢［1－3］。

登革病毒基因組編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM、E)和7 個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中，結(jié)構(gòu)蛋白E包括3個結(jié)構(gòu)域:I區(qū)、II區(qū)和III區(qū)，其中III區(qū)含有IgG免疫球蛋白樣折疊，并通過二硫鍵穩(wěn)定自身結(jié)構(gòu)，是登革病毒與宿主細胞結(jié)合的主要位點，也是誘導機體產(chǎn)生保護性中和抗體和血凝抑制抗體的主要部位［4－9］。本研究分別將去除C端跨膜區(qū)的登革病毒4型E蛋白(DENV4E，402AA)以及 E 蛋白 III區(qū)(DENV4EIII，126AA)克隆到pET-32a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建兩種蛋白的表達載體，并利用 IPTG分別誘導 DENV4E與DENV4EIII蛋白在原核細胞中大量表達，以表達的蛋白免疫家兔并采集血清，分別制備出針對DENV4E與DENV4EIII蛋白的多克隆抗體，并對其進行鑒定，從而為進一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Rosetta感受態(tài)細胞和pET-32a(+)質(zhì)粒(成都生物制品研究所有限責任公司病毒疫苗研究室保存);TOP10感受態(tài)細胞(北京天根公司);含有登革病毒4型(814669株)E蛋白編碼序列的TOPOD4prM/E質(zhì)粒(上海英駿生物技術有限公司構(gòu)建);登革病毒4型(H241株)(美國疾病控制與預防中心提供);PrimeSTAR DNA聚合酶與異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Takara公司);凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒抽提試劑盒(Qiagen公司);BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶(NEB公司);脫脂奶粉(BD公司)、堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG、BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物技術研究所);弗氏完全佐劑與不完全佐劑(Sigma-Aldrich公司);核苷酸序列測定(上海英駿生物技術有限公司);免疫用雌性家兔(普通級，體質(zhì)量2.5～3.5 kg)［成都生物制品研究所有限責任公司動物室，許可證號SCXK(川)2011-08］。

1.2 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達載體的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)登革病毒4型(814669株)序列(GenBank登錄號AF326573.1)設計引物，用于擴增DENV4E與DENV4EIII片段(去除C端跨膜區(qū))，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，序列如下:DENV4E:5'-CGCGGATCCATGCGATGCGTAGGAGTAGGAAAC-3'(正向，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點);5'-C CGCTCGAGTTAAAACATCTTGCCAATGGAACTCC-3'(反向，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點);DENV4EIII:5'-CGCGGATCCTGCAAAGTCCGTATGGAGAAA-3'(正向，下劃線部分為BamHⅠ酶切位點);5'-CCGCTC GAGTTATTTTGCACCTCTGTATGTGGACT-3'(反向，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點)。

以 TOPO-D4prM/E質(zhì)粒為模板，采用 Prime-STAR DNA聚合酶擴增DENV4E與DENV4EIII片段，切膠回收擴增產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pET-32a(+)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切后通過T4 DNA連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細胞后挑取克隆，對重組質(zhì)粒進行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定以及測序分析，將插入序列正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET32-DENV4E和pET32-DENV4EIII。

1.3 DENV4E與DENV4EIII蛋白的表達

分別用 pET-32a(+)質(zhì)粒、pET32-DENV4E以及pET32-DENV4EIII表達載體轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞，陽性克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后，在37℃以1 mmol/L IPTG誘導表達4 h，離心收集菌體，通過SDS-PAGE檢測DENV4E和DENV4EIII蛋白表達，并以裂解緩沖液重懸菌體，冰浴中超聲裂解，離心收集上清液和沉淀，通過SDS-PAGE檢測DENV4E和DENV4EIII蛋白為可溶性表達或是以包涵體形式表達。

先后以2 mol/L尿素洗滌和8 mol/L尿素溶解DENV4E與DENV4EIII包涵體，通過 SDS-PAGE檢測蛋白純度，并采用Lowry法測定蛋白濃度。

1.4 DENV4E與DENV4EIII多克隆抗體的制備

分別用表達的DENV4E與DENV4EIII蛋白免疫家兔，首次免疫后14及21 d進行加強免疫，首次免疫以弗氏完全佐劑乳化，加強免疫以弗氏不完全佐劑乳化，每次免疫的蛋白量約為1 mg。另以8 mol/L尿素免疫家兔作為對照。末次免疫后7 d采集血清。

1.5 多克隆抗體的Western blot鑒定

取適量登革病毒4型(H241株)全病毒裂解物進行12%SDS-PAGE電泳，蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以溶解于PBS的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用上述制備的多克隆抗體以及陰性對照血清(牛奶稀釋，稀釋度均為1∶40)4℃孵育過夜。PBS洗膜，以堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG室溫孵育1.5 h，PBS洗膜后以BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 pET32-DENV4E與 pET32-DENV4EIII表達載體的構(gòu)建與鑒定

PCR擴增得到的 DENV4E(1206 bp)與DENV4EIII(378 bp)片段分別插入pET-32a(+)質(zhì)粒后，取大小正確的重組質(zhì)粒(圖1)進行BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果與預期一致(圖2)。核苷酸序列測定顯示插入片段與目的片段序列完全一致且讀碼框正確。

圖1 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達載體Fig 1 pET32-DENV4E and pET32-DENV4EIII expression vectors

2.2 DENV4E與DENV4EIII蛋白的誘導表達

圖2 pET32-DENV4E與pET32-DENV4EIII表達載體的酶切鑒定Fig 2 Restriction enzyme digestion of pET32-DENV4E and pET32-DENV4EIII

含有 pET32-DENV4E與 pET32-DENV4EIII表達載體的Rosetta感受態(tài)細胞經(jīng)IPTG誘導表達后，可見明顯蛋白條帶，分別與DENV4E和DENV4EIII蛋白的預期相對分子質(zhì)量相符(DENV4E:64 ku;DENV4EIII:33 ku)(圖3)。菌體經(jīng)超聲裂解后，結(jié)果顯示兩種蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中(圖4)。以尿素洗滌和溶解包涵體，能夠得到純度較高的DENV4E和DENV4EIII蛋白(圖5)。蛋白濃度可達1.0 g/L左右。

圖3 Rosetta菌體裂解物的SDS-PAGE檢測Fig 3 SDS-PAGE of Rosetta cell lysates

圖4 Rosetta菌體超聲裂解后上清液與沉淀的SDS-PAGE檢測Fig 4 SDS-PAGE of the supernatant and pellet of Rosetta cells after sonication

圖5 DENV4E與DENV4EIII蛋白經(jīng)純化后的SDS-PAGE檢測Fig 5 SDS-PAGE of purified DENV4E and DENV4EIII proteins

2.3 多克隆抗體的Western blot鑒定

DENV4E、DENV4EIII多克隆抗體與登革病毒4型(H241株)全病毒裂解物雜交后，均在病毒E蛋白相應位置(55 ku)出現(xiàn)明顯條帶，而陰性對照血清與全病毒裂解物雜交后未出現(xiàn)條帶(圖6)。

圖6 多克隆抗體對登革病毒4型的Western blot檢測Fig 6 Western blot of dengue virus type 4 using the prepared polyclonal antibody

3 討論

位于登革病毒表面的E蛋白是其最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，介導諸多功能。E蛋白包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ區(qū)等3個結(jié)構(gòu)域，其中III區(qū)為IgG免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，含有型和亞型特異性抗原表位，可誘導機體產(chǎn)生中和抗體［4－9］。由于目前尚無市售的針對登革病毒4型E蛋白的特異性抗體，因此對該型病毒的研究造成了一定困難。為解決這一問題，本研究在原核細胞中表達登革病毒4型E蛋白與E蛋白III區(qū)，并通過免疫家兔制備多克隆抗體。為提高目的蛋白的表達效率，本研究去除了 E蛋白編碼序列 C端約300 bp的跨膜區(qū)，獲得了表達量較好的蛋白，其結(jié)果與文獻［10］的研究結(jié)果一致。此外，本研究以pET-32a(+)質(zhì)粒作為載體，表達出硫氧還蛋白與目的蛋白的融合蛋白，以促進目的蛋白的可溶性表達。但在對表達溫度、時間及IPTG濃度等條件進行優(yōu)化后，并不能顯著增大蛋白的可溶性，DENV4E與DENV4EIII蛋白仍然主要以包涵體的形式表達。經(jīng)尿素洗滌、溶解后，蛋白濃度可達1.0 g/L左右，可達到本研究的需求。推測兩種蛋白以包涵體的形式表達可能是由其序列本身所決定的。

登革病毒4型完整E蛋白的相對分子質(zhì)量為55 ku，去除C端跨膜區(qū)的E蛋白及其III區(qū)分別為45與14 ku，由于N端融合了硫氧還蛋白，因此最終表達的DENV4E與DENV4EIII分別為64與33 ku。盡管并非完整的E蛋白，但由于兩者均含有E蛋白的主要抗原表位，因此兩者足以誘導家兔產(chǎn)生高水平的免疫反應，所制備的多克隆抗體能夠從登革病毒4型全病毒裂解物中成功檢測到完整的病毒E蛋白(55 ku)。需要指出的是，所制備的抗體在對病毒裂解物進行檢測時出現(xiàn)了非特異性條帶，其原因可能是因為多抗的特異性無法與單抗相比，以及病毒表面的E蛋白同源二聚體可能與多抗發(fā)生反應。但總體而言，考慮到目標條帶清晰，且非特異性條帶未對結(jié)果造成干擾，因此本研究制備的多克隆抗體的檢測效果是可接受的。該研究結(jié)果為登革病毒E蛋白抗原表位肽及登革亞單位疫苗的研究提供了依據(jù)，也解決了登革疫苗開發(fā)中所面臨的抗登革病毒抗體缺乏的瓶頸問題。

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