王 晴，劉正娟，馬 樂(lè)，趙永利，白雪梅

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，遼寧大連 116027)

水通道蛋白-1在急性肺損傷中的表達(dá)及意義

王 晴，劉正娟，馬 樂(lè)，趙永利，白雪梅

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院兒科，遼寧大連 116027)

［目的］探討水通道蛋白1(AQP-1)在脂多糖(LPS)所致的急性肺損傷(ALI)中的作用。［方法］根據(jù)是否腹腔注射脂多糖(LPS)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為脂多糖組(LPS組)及生理鹽水對(duì)照組(Con組)，對(duì)比兩組動(dòng)物組織病理學(xué)改變、動(dòng)脈血?dú)狻⒎螡?干重比及AQP-1表達(dá)的差異。［結(jié)果］光鏡下見LPS組肺組織水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);LPS組 PO2(55.07±17.02)mmHg明顯低于 Con組(97.35 ±9.37)mmHg，差異有顯著性意義，P＜0.05;LPS組肺濕/干重比(4.93 ±0.16)明顯高于 Con組(4.11±0.69)，差異有顯著性意義，P＜0.05;免疫組化染色顯示:LPS 組的AQP-1蛋白表達(dá)減弱，熒光實(shí)時(shí)定量PCR證實(shí)LPS組的AQP-1 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)。［結(jié)論］AQP-1參與了急性肺損傷的形成。

急性肺損傷;脂多糖;水通道蛋白-1

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，常成為多臟器功能衰竭的始動(dòng)因素，發(fā)病迅速，缺乏有效的治療方法，且其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，因此給臨床治療帶來(lái)諸多問(wèn)題。研究表明水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)與肺水腫有關(guān)，水通道蛋白是一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。近年逐漸發(fā)現(xiàn)了13種水通道蛋白，其中AQP-1主要分布于肺微血管內(nèi)皮［1］，對(duì)于維持血管與間質(zhì)之間水運(yùn)動(dòng)的平衡有重大意義，它的發(fā)現(xiàn)在分子水平揭示了水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)的基本機(jī)制。肺水腫以肺泡和肺間質(zhì)內(nèi)液體積聚為特點(diǎn)，發(fā)生時(shí)必然伴有水轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂及水通道蛋白功能改變，因此充分認(rèn)識(shí)肺臟水通道蛋白的作用對(duì)臨床治療肺水腫具有重要意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)導(dǎo)致的 ALI幼鼠AQP-1表達(dá)的研究，明確AQP-1在幼鼠ALI發(fā)生機(jī)制中的作用，為ALI的治療提供新的研究途徑。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性幼年(6～8周齡)SD大鼠20只，體質(zhì)量150～200 g，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部。隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(Con組)、脂多糖組(LPS組)，每組10只。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 主要試劑

LPS(0111:B4，Sigma公司)、水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)、Mayer蘇木素(Sigma公司)、SP試劑盒和DAB試劑盒(武漢博士德生物試劑有限公司)、AQP-1抗體(Chemicon公司)、血?dú)夥治鰞x(ABL-800)、RT-PCR試劑及儀器均由大連寶生物公司提供。

1.3 動(dòng)物模型的建立

稱重后，7%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定。LPS組經(jīng)腹腔緩慢注射LPS 5 mg/kg，Con組在相同時(shí)間點(diǎn)給予相當(dāng)量的生理鹽水。LPS或生理鹽水注射6 h后放血處死動(dòng)物。

1.4 血?dú)夥治?/h3>

LPS推注30 min及6 h后(處死動(dòng)物前)，各組經(jīng)頸外動(dòng)脈采血1 mL，后立即用自動(dòng)血?dú)夥治鰞x測(cè)定 pH、PaCO2、PaO2。

1.5 肺濕重/干重比(W/D)測(cè)定與病理檢查

取左肺稱濕重(W)后，置70℃溫箱，48 h后(質(zhì)量不再減輕)稱干重(D)，計(jì)算W/D比值。取各標(biāo)本右下肺葉經(jīng)10%甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察病理改變。肺損傷病理結(jié)果的判斷，根據(jù)炎癥和上皮細(xì)胞脫落程度將炎癥分為4級(jí):“-”未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);“+”少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管結(jié)構(gòu)完整;“+++”見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見管壁破壞及(或)上皮脫落;“++”介于“+”和“+++”之間。

1.6 AQP-1的免疫組化染色

右下肺組織經(jīng)石蠟包埋切片后，檢測(cè)AQP-1在肺內(nèi)的表達(dá)。石蠟包埋組織切成4 μm切片，用于H-E及免疫組化染色。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性氧化酶，微波抗原修復(fù)，余步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。用已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以 PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。AQP-1抗體稀釋濃度為1∶100。細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色著染者為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肺組織AQP-1 mRNA表達(dá)

用TRIzol(Invitrogen公司產(chǎn)品)試劑提取右肺中葉組織總RNA，并對(duì)其進(jìn)行Dnase處理，測(cè)定在260 nm下的OD值，計(jì)算RNA純度及含量。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)AQP-1 mRNA表達(dá)水平。試劑盒購(gòu)置于TaKaRa公司。AQP-1引物上游5'- GACTACACTGGCTGTGGGATCAA -3'，下游5'- CCAGGGCACTCCCAATGAA -3'，由 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real Time System分析儀完成，總反應(yīng)體積為 25 μL，含有40 pmol各引物，2 μL cDNA。反應(yīng)條件:95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃ 20 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，4 0 個(gè)循環(huán);以 ACTB(引物上游5'- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3')作為內(nèi)參照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，各組指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為檢驗(yàn)的顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)脈血?dú)獗容^

所有實(shí)驗(yàn)大鼠吸氧濃度均為21%，故以動(dòng)脈血氧分壓PO2代替氧合指數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示Con組PO2(97.35 ±9.37)mmHg，注射 LPS 6 h 后 PO2(55.07±17.02)mmHg，LPS 組與 Con 組比較 PO2明顯下降，兩組比較差異有顯著性意義，P＜0.05。

2.2 肺濕/干重比(W/D)測(cè)定比較

LPS 組肺濕/干重為(4.93 ±0.16)，顯著高于正常Con組(4.11±0.69)，兩組比較差異有顯著性意義，P ＜0.05。

2.3 大鼠肺組織病理改變

光鏡下可見LPS組血管周圍間隙增寬，大量淡粉色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);肺間隔增寬，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞為主，可見少量淋巴細(xì)胞，部分肺間隔變薄、斷裂，有肺氣腫形成;肺內(nèi)可見微血栓灶性出血及肺不張;肺泡腔內(nèi)可見出血、炎癥細(xì)胞及液體滲出，分級(jí)(+++)。生理鹽水對(duì)照組肺間質(zhì)和肺泡未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，分級(jí)(-)。見圖1。

2.4 AQP-1蛋白在肺組織中的表達(dá)

Con組AQP-1蛋白免疫組化顯示肺組織呈棕黃色，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、黏膜下腺、氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，LPS組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞呈淺棕黃色，提示AQP-1蛋白表達(dá)減弱(圖2)。

圖1 SD大鼠肺組織H-E染色 ×200Fig 1 The pathological examination degree of the two groups

圖2 肺組織AQP-1免疫組化染色 ×200Fig 2 Immunohistochemical analysis of AQP-1 expressed in microvascular endothelial cells

2.5 AQP-1 mRNA在肺組織中的表達(dá)

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)肺組織中AQP-1 mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示:LPS組的AQP-1 mRNA 表達(dá)量為(0.34 ±0.08)，較對(duì)照組(0.48±0.11)明顯降低，差異有顯著性意義(P＜0.01)。

3 討 論

急性肺損傷(ALI)是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，有研究表明LPS是引起ALI的重要致病因子［2-3］。以往人們普遍認(rèn)為，肺水腫主要是由于肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(LMECs)受損所致，而對(duì)肺組織存在的水通道蛋白(AQPs)在病理生理?xiàng)l件下的作用認(rèn)識(shí)不足。AQPs是一類可調(diào)節(jié)水進(jìn)出細(xì)胞膜的水通道同源蛋白家族的總稱，自從1988年 Agre等發(fā)現(xiàn)AQP-1以來(lái)，目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)13種AQPs亞型(AQP0～12)，其主要功能是介導(dǎo)自由水的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)，為水的快速轉(zhuǎn)運(yùn)提供了一個(gè)主要通路。其中分布于肺組織中在肺內(nèi)液體的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)方面具有重要作用的是 AQP -1［4-5］，AQP -1 在細(xì)胞膜中由 4 個(gè)單體組成，每一個(gè)單體含有一個(gè)水孔通道，水通過(guò)這些高選擇性的通道不需要耗能，同時(shí)可阻止離子的通過(guò)，因而保持了膜電位的穩(wěn)定。

AQPs功能均不受溫度和脂質(zhì)膜成分影響，而且不存在開放和關(guān)閉的功能狀態(tài)，只要有滲透壓梯度就有水分子順滲透壓梯度通過(guò)水孔通道。AQP-1主要負(fù)責(zé)清除支氣管和脈管周圍組織內(nèi)的水分，King等［6］人的研究發(fā)現(xiàn)正常人靜脈注入大量生理鹽水后造成細(xì)支氣管旁水腫，而先天缺乏AQP-1的個(gè)體未呈現(xiàn)上述變化。研究顯示，AQP-1基因敲除小鼠與野生型相比，肺內(nèi)滲透壓依賴被動(dòng)性水轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制90%，而且在新生小鼠肺內(nèi)液體大量吸收的關(guān)鍵時(shí)期，AQP-1的表達(dá)大量增加［7-8］。此外，研究還證實(shí)剔除 AQP-1可中度降低靜水壓差所致的跨毛細(xì)血管液體轉(zhuǎn)運(yùn)，這些研究說(shuō)明AQP-1在肺水轉(zhuǎn)運(yùn)以及肺水腫的發(fā)病機(jī)理中可能起著重要的作用［9］。

對(duì)于AQP-1在肺臟中表達(dá)部位的研究，不同文獻(xiàn)報(bào)道不一。本研究通過(guò)對(duì)LPS所致急性肺損傷幼鼠肺組織標(biāo)本的免疫組化染色證實(shí)AQP-1在肺組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞、黏膜下腺、氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮均有表達(dá)。此結(jié)果與張成等［10］通過(guò)對(duì)人體肺組織標(biāo)本的研究相一致。

然而對(duì)于ALI中AQPs在肺組織中的表達(dá)增高還是降低，目前仍有爭(zhēng)議。大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)研究表明ALI后 AQPs表達(dá)下降［11］，本研究免疫組化顯示AQP-1蛋白在Con組肺組織呈棕黃色，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞、黏膜下腺、氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮表達(dá)，而LPS組在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)減弱，呈淺棕黃色。而且熒光實(shí)時(shí)定量PCR證明LPS組大鼠AQP-1 mRNA表達(dá)明顯降低。

本研究結(jié)果顯示LPS所致急性肺損傷中幼鼠肺組織濕/干重較正常組升高，同時(shí)，AQP-1表達(dá)明顯下調(diào)，提示AQP-1對(duì)間質(zhì)水腫形成和吸收起重要作用，其機(jī)制可能是 AQP-1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致跨細(xì)胞水轉(zhuǎn)運(yùn)的速率降低，從而影響水腫液吸收，這與劉琳等［12］的研究觀點(diǎn)一致。因此，通過(guò)提高AQP-1含量或者活性，增強(qiáng)肺水腫患者肺泡水清除率，可能是治療肺水腫的有效途徑，也為急性肺損傷提供了新的治療思路。

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Expression of AQP-1 in acute lung injury induced by lipopolysacharide in rats

WANG Qing，LIU Zheng-juan，MA Le，ZHAO Yong-li，BAI Xue-mei
(Department of Pediatrics，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China)

Abstract:［Objective］To investigate the expression and effect of AQP-1 in acute lung injury(ALI)induced by lipopolysaccharide.［Methods］Twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into LPS group treated with LPS injection and normal control group injected with saline(Control group).Arterial oxygen tension(PaO2)and wet/dry mass ratio(W/D)were tested at 6th hour after the injection.The expressions of AQP-1 protein in the lungs of rats were detected by immunohistochemistry and the expressions of AQP-1 mRNA were measured by a real-time fluorescence PCR.［Results］The arterial oxygen tension(PaO2)in LPS group was obviously lower than that in control group(55.07 ±17.02)mmHg vs(97.35 ±9.37)mmHg(P＜0.05).The wet/dry mass ratio(W/D)in LPS group was obviously higher than that in control group(4.93 ±0.16 vs 4.11 ±0.69，P＜0.05).The immunostaining showed a significant decrease in the expression of AQP-1 and a real time RT-PCR confirmed that the levels of AQP-1 mRNA were significantly reduced in LPS group(P＜0.01)at 6 h after LPS injection.［Conclusion］AQP -1 has an great effect in acute lung injury(ALI).

Key words:acute lung injury;lipopolysaccharide;aquaporin-1

Q74

A

1671-7295(2012)01-0022-04

遼寧省教育廳高校科研項(xiàng)目(L2010119)

2011-10-18;

2011-12-09

王晴(1987-)，女，遼寧興城人，碩士研究生。

白雪梅，教授。E-mail:xuemei-bai@163.com