宋新強(qiáng)，駱 媛，李倩倩，董晶晶，甘小青，馬 云

1)信陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)教研室信陽(yáng)464000 2)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院北京100071

(2011-03-25收稿 責(zé)任編輯 李沛寰)

研究［1-3］表明抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)直接與抗原特異的T細(xì)胞接觸能夠誘導(dǎo)出特異的耐受性APC，這種APC會(huì)特異地抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞，所以，使用這種耐受性APC治療T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)是目前國(guó)際上公認(rèn)的關(guān)節(jié)炎模型。由于膠原不溶于水，一般使用弱酸來(lái)溶解，為避免溶解膠原所使用的醋酸影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，作者用膠原上的抗原肽表位(collagen tolerance epitope，CTE)1和 CTE2(即T細(xì)胞決定簇)代替膠原刺激APC，擬利用TGF-β處理和CTE誘導(dǎo)的APC來(lái)探索治療關(guān)節(jié)炎的療效，希望為臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎摸索出一種全新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 腫瘤生長(zhǎng)因子(tumor growth factor-β，TGF-β2)、雞Ⅱ型膠原(Type Ⅱ collagen，CⅡ)、佛波醇酯、離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能菌素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;FITC標(biāo)記的抗IFN-γ單克隆抗(mAb)、PE標(biāo)記的抗IL-4 mAb均購(gòu)自美國(guó)BD公司，流式細(xì)胞分析儀由美國(guó)BD公司制造。CTE1和CTE2根據(jù)文獻(xiàn)［4］的方法表達(dá)、純化獲得。

1.2 免疫性APC與耐受性APC的獲得 免疫性APC與耐受性APC參考文獻(xiàn)［5］通過(guò)體外誘導(dǎo)產(chǎn)生。Wistar大鼠腹腔注射6 mL 30 g/L的巰基乙酸鹽溶液，3 d后收集腹膜滲出細(xì)胞(peritoneal exudate cell，PEC)。PEC 在含 500 mg/L CTE 和 5 μg/L TGF-β2的無(wú)血清培養(yǎng)液中過(guò)夜，即獲得耐受性APC;培養(yǎng)液中不加TGF-β2，獲得免疫性 APC。培養(yǎng)后，細(xì)胞用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)洗3次，除去CTE和TGF-β2，貼壁細(xì)胞在4℃PBS中培養(yǎng)2 h后，用移液管吹起，用HBSS洗3次并重懸，調(diào)整最終濃度為1 ×107L－1。

1.3 動(dòng)物模型的建立與分組 雌性Wistar大鼠購(gòu)于北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，體質(zhì)量(190±15)g，飼養(yǎng)在清潔級(jí)環(huán)境中。32只大鼠分為4組，即關(guān)節(jié)炎組、免疫性細(xì)胞組、耐受性細(xì)胞組和正常對(duì)照組，每組8只。將雞CⅡ用0.01 mmol/L的冰醋酸溶解后，配成4 g/L的溶液，加等體積完全福氏佐劑，使終濃度為2 g/L。以0.1 mL/只在尾根部和背部多點(diǎn)注射，1周后從腹部注射0.1 mL/只加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后1周，分別給免疫性細(xì)胞、耐受性細(xì)胞和關(guān)節(jié)炎組大鼠尾靜脈一次性注射免疫性APC(1×106個(gè)細(xì)胞/大鼠)、耐受性APC(1×106個(gè)細(xì)胞/大鼠)和HBSS，正常對(duì)照組不注射任何物質(zhì)，1周后開(kāi)始檢查各種指標(biāo)。

1.4 大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評(píng)估 大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度按0～4級(jí)評(píng)分［4］:無(wú)腫脹為0分;趾關(guān)節(jié)稍腫為1分;小趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹為2分;踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹為3分;包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹為4分。四肢關(guān)節(jié)腫脹評(píng)分之和為每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最高可達(dá)16分。

1.5 血清中抗CⅡ抗體的檢測(cè) 細(xì)胞輸入4周后，從尾部靜脈取血，離心后－20℃儲(chǔ)藏備用?？贵w的檢測(cè)參照Fujii等［5］的方法進(jìn)行。以酶標(biāo)分光光度計(jì)490 nm處的吸光度(A)值表示。

1.6 外周血中Th1、Th2細(xì)胞的檢測(cè) 取外周血淋巴細(xì)胞置于48孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 mL，加佛波醇酯(50μg/L)、離子霉素(500μg/L)和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑莫能菌素(2μmol/L)在37℃孵箱中培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞分為對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管，分別加入抗 CD4 mAb混勻，室溫放置20 min對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。加入固定/破膜細(xì)胞液200μL，4℃放置20 min，實(shí)驗(yàn)管分別加入FITC標(biāo)記的抗IFN-γmAb、PE標(biāo)記的抗 IL-4 mAb，4℃避光孵育30 min后，用1 mL Perm/Wash液洗滌2次，最后以300μL PBS重懸細(xì)胞，24 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析，用Cellsquest軟件獲取并分析數(shù)據(jù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.0進(jìn)行分析，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，抗CⅡ抗體A值，Th1、Th2型細(xì)胞及其比率比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較用SNK-q法進(jìn)行。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)、CIA發(fā)生率以及其外周血抗CⅡ抗體水平比較 正常對(duì)照組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)為0，其他3組各指標(biāo)比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和外周血抗CⅡ抗體A值比較

2.2 4組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞中Th1和Th2型細(xì)胞比例 見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠外周血Th1與Th2型細(xì)胞的比例

3 討論

Faunce等［6］用 TGF-β 處理髓磷脂堿性蛋白誘導(dǎo)的APC抑制了實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎;Zhang-Hoover等［7］用 TGF-β 處理卵清蛋白誘導(dǎo)的APC阻止了呼吸道過(guò)敏。Sundo等［8］利用TGF-β處理、雞CⅡ誘導(dǎo)的APC抑制了膠原誘導(dǎo)的CIA。該實(shí)驗(yàn)使用的抗原是雞CⅡ的CTE1和CTE2，此2個(gè)抗原表位是T細(xì)胞識(shí)別的關(guān)鍵部位。CTE2(CⅡ中包括260～270氨基酸)是進(jìn)化上高度保守的片段，在人、牛、雞等動(dòng)物中高度同源，CTE1(CⅡ 中包括190～200氨基酸)只在雞膠原中存在，此串連的抗原肽已經(jīng)在本實(shí)驗(yàn)室純化成功［4］。該文中使用CTE誘導(dǎo)、TGF-β2刺激的APC一次性尾部注射，不但成功降低了CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的腫脹指數(shù)，而且明顯減少了血清中的抗CⅡ抗體的濃度，誘導(dǎo)了外周血中Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞的偏移?？笴Ⅱ抗體的濃度被認(rèn)為是反映關(guān)節(jié)炎復(fù)雜程度以及關(guān)節(jié)軟骨破壞的重要指標(biāo)，血清中抗CⅡ 抗體濃度的高低與炎癥因子的濃度高低是正相關(guān)的［9-11］。血清中分泌炎癥因子的Th1細(xì)胞向分泌抗炎性因子的Th2細(xì)胞偏移，與作者［9］以前采用CTE喂服CIA大鼠以及使用編碼CⅡ蛋白的基因治療CIA大鼠的效果類似，都是誘導(dǎo)了大鼠對(duì)自身CⅡ的耐受。

實(shí)驗(yàn)中采用5μg/L TGF-β2作為刺激APC的細(xì)胞因子是參考Faunce等［6］所用的濃度，但到底使用多大濃度刺激、處理多長(zhǎng)時(shí)間能達(dá)到最佳效果，也需要進(jìn)一步探討。van Duivenvoorde等［12］用牛CⅡ誘導(dǎo)、TNF-α刺激的樹(shù)突狀細(xì)胞也抑制了小鼠CIA的發(fā)展，并且產(chǎn)生了Th2型的細(xì)胞因子，如IL-4、IL-5等，這也說(shuō)明在使用細(xì)胞因子上TGF-β2并非是惟一的刺激因素，也可能有多種未發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，抑或是多種刺激因子共同作用效果會(huì)更好。該文中APC是通過(guò)CTE誘導(dǎo)、TGF-β2刺激產(chǎn)生的PEC，這種APC是一種混合物，具體是哪種APC(DC、B細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞)參與了耐受的誘導(dǎo)，都需要做進(jìn)一步分析。

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