吳淵文,宋文全,周晨曦,丁 俊
(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)
腎臟保存質(zhì)量對腎臟移植效果有決定性作用,因此器官保存液的改進越來越受重視。隨著器官移植過程中的缺血-再灌注損傷理論的發(fā)展,減少腎臟缺血-再灌注損傷成為提高腎臟移植成功率的重要途徑。動物實驗表明川芎嗪應(yīng)用于腎臟低溫保存后,對腎臟缺血和再灌注損傷有保護作用[1]。本實驗通過在高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液(HC-A液)中加入川芎嗪并進行草犬腎臟低溫保存及移植實驗,進一步檢驗川芎嗪對腎臟保存質(zhì)量的影響,為臨床應(yīng)用提供參考。
1.1 實驗動物 體重11~13 kg的健康雄性草犬20條,2歲,由第二軍醫(yī)大學(xué)動物研究所提供,實驗動物許可證號:SYXK(滬)2009-0088。
1.2 實驗藥品 HC-A液由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院制劑室提供,川芎嗪由北京醫(yī)藥工業(yè)研究所提供。
1.3 腎臟保存實驗
1.3.1 實驗分組 草犬20條隨機分為4組,每組5條,I組、II組分別用4℃HC-A液對供腎進行灌注保存24、48 h;III組、IV組分別用4℃含川芎嗪(4 mg/L)的HC-A液對供腎進行灌注保存24、48 h。
1.3.2 實驗方法 草犬術(shù)前靜脈血測肌酐。以戊巴比妥基礎(chǔ)麻醉成功后,行腹部正中縱行切口;將其左腎迅速切除,以2~4℃的保存液灌注直至腎靜脈流出液清亮,腎臟變?yōu)榫鶆蛏n白,灌注量約為100~150 ml,壓力為7.84 ~9.81 kPa(80 ~100 cmH2O),并在0~4℃條件下分別保存24、48 h。再將左腎移植回草犬體內(nèi),同時行對側(cè)腎臟摘除術(shù)。精心飼養(yǎng)手術(shù)后的草犬,記錄其存活時間,并檢測其腎臟功能(分別于術(shù)后第2、3、5、7、14天抽靜脈血測肌酐)。以2~4℃的保存液灌洗切下的對側(cè)腎臟并在0~4℃條件下保存24、48 h,行光鏡和電鏡下的形態(tài)學(xué)觀測。
1.4 檢測指標 ①以光鏡和電鏡觀察腎組織在兩組保存液中保存24、48 h后的細胞形態(tài)學(xué)變化。②腎移植受犬術(shù)后存活時間及腎臟功能狀況。
2.1 形態(tài)學(xué)變化
2.1.1 Ⅰ組 光鏡所見腎小球結(jié)構(gòu)基本完整,可見少量變性的腎小管上皮(圖1);電鏡所見核形大致正常,核質(zhì)分布均勻,線粒體不同程度腫脹,嵴數(shù)量有所減少,但排列尚規(guī)律,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度水腫,近曲小管微絨毛少量水腫、脫落。毛細血管內(nèi)皮細胞、足突細胞尚可分辨(圖2)。
圖1 光鏡顯示Ⅰ組腎結(jié)構(gòu)圖(HE×100)
圖2 電鏡顯示Ⅰ組腎結(jié)構(gòu)圖(×5000)
2.1.2 Ⅱ組 光鏡所見腎小球毛細血管輪廓略模糊,小管上皮廣泛的中、重度變性,可見數(shù)個小灶狀小管壞死(圖3);電鏡所見核嚴重變形、核質(zhì)固縮,核膜不規(guī)整,線粒體顯著腫脹,嵴斷裂、溶解明顯,微絨毛分布散亂,大片脫落(圖4)。
圖3 光鏡顯示Ⅱ組腎結(jié)構(gòu)圖(HE×100)
圖4 電鏡顯示Ⅱ組腎結(jié)構(gòu)圖(×5000)
2.1.3 Ⅲ組 光鏡所見腎組織結(jié)構(gòu)改變輕微,可見輪廓清晰的腎小球、腎小管,除少量腎曲管輕度濁腫外,大部分腎曲管結(jié)構(gòu)正常(圖5);電鏡所見核形大致正常,核質(zhì)分布均勻,線粒體輕微腫脹,但嵴排列尚良好,個別嵴膜間隙略增寬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦有輕度腫脹。近曲小管上皮細胞微絨毛水腫、增粗,個別脫落。毛細血管內(nèi)皮與濾過膜內(nèi)皮細胞輕微水腫,結(jié)構(gòu)尚清(圖6)。
2.1.4 Ⅳ組 光鏡所見腎小球毛細血管輪廓略模糊,較多腎曲管上皮呈輕中度腫脹變性,胞漿內(nèi)紅染的顆粒數(shù)目明顯增多,且顆粒增粗,偶見曲管上皮小灶狀壞死(圖7);電鏡所見核略變形,核質(zhì)呈邊聚現(xiàn)象,部分核質(zhì)固縮,線粒體多數(shù)腫脹,嵴減少、排列紊亂,甚至破壞、溶解。近曲小管微絨毛有較多斷裂、脫落。毛細血管內(nèi)皮細胞、足突細胞結(jié)構(gòu)不清(圖8)。
從光鏡及電鏡結(jié)果看,以兩組保存液分別保存24 h的犬腎組織損傷(主要是腎小球、腎小管損傷)無明顯差別,腎細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核均保持正常,但以含川芎嗪的HC-A液組在保存48 h后犬腎組織損傷明顯輕于HC-A組。
圖5 光鏡顯示Ⅲ組腎結(jié)構(gòu)圖(HE×100)
圖6 電鏡顯示Ⅲ組腎結(jié)構(gòu)圖(×5000)
圖7 光鏡顯示Ⅳ組腎結(jié)構(gòu)圖(HE×100)
圖8 電鏡顯示Ⅳ組腎結(jié)構(gòu)圖(×5000)
2.2 移植腎功能指標 Ⅰ組、Ⅲ組液體低溫保存供腎24 h,移植后血肌酐差異無統(tǒng)計學(xué)意義;低溫保存供腎48 h,Ⅳ組血肌酐值明顯低于Ⅱ組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P <0.05,表1)。
表1 四組低溫保存草犬供腎24、48 h后行腎移植手術(shù)前后血肌酐變化(μmol/L,±s)
表1 四組低溫保存草犬供腎24、48 h后行腎移植手術(shù)前后血肌酐變化(μmol/L,±s)
注:與Ⅱ組同期比較,*P <0.05
組別 術(shù)前 第2天 第7天 第14天Ⅰ組(24 h)74.0 ±6.5 244.6 ±58.3 85.3 ±7.1 83.7 ±7.1Ⅱ組(48 h)74.8 ±6.0 319.6 ±72.4 232.3 ±54.3 139.6 ±15.9Ⅲ組(24 h)74.2 ±5.5 287.4 ±69.8 84.5 ±8.3 82.6 ±7.3Ⅳ組(48 h)74.7 ±5.7 265.8 ±66.1* 166.9 ±43.3* 96.7 ±11.8*
2.3 草犬腎臟移植后存活情況 移植后草犬存活數(shù)(>14 d)分別為:Ⅰ組為5條,Ⅱ組為3條,Ⅲ組為5條,Ⅳ組4條。
器官保存的缺血和再灌注損傷理論中普遍認可的是氧自由基毒性學(xué)說和鈣離子超負荷學(xué)說,兩者相互關(guān)聯(lián),導(dǎo)致細胞膜性結(jié)構(gòu)破壞以及線粒體功能障礙、ATP生成和儲備減少,從而不能修復(fù)受損的組織細胞[2-3]。我國學(xué)者嘗試從中藥中篩選高效低毒的藥物減輕缺血和再灌注損傷,已取得一定成績。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一,藥理研究證明,其鹽酸鹽和碳酸鹽均具有抗血小板聚集作用,能擴張小動脈改善微循環(huán)和腦血流,提高組織耐受缺血缺氧的能力[4]。川芎嗪還具有鈣離子拮抗效應(yīng),能抑制離體細胞對鈣離子的攝入,避免了細胞內(nèi)鈣離子超載引起的細胞損傷[5]。
器官組織形態(tài)學(xué)的改變可以較直接地反映器官組織結(jié)構(gòu)損傷。光鏡可以粗略地反映損傷情況,集中表現(xiàn)在腎小球的結(jié)構(gòu)輪廓及曲管細胞的變性、壞死的程度和范圍。而電鏡則細致地反映出細微組織損傷情況,其中有代表性的改變是線粒體[6-7]。線粒體發(fā)生輕度溶解變性或腫脹變性均屬于可逆性代謝性改變,仍能進行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)。只有當(dāng)內(nèi)外膜脹裂、基質(zhì)逸出時才失去功能[8-9]。
從光鏡及電鏡結(jié)果看,兩組保存液在保存24 h的犬腎組織損傷(主要是腎小球、腎小管損傷)無明顯差別;在保存48 h時含川芎嗪的HC-A液組的犬腎組織損傷明顯輕于HC-A液組,表現(xiàn)為腎細胞內(nèi)線粒體溶解變性或腫脹變性程度明顯減輕。移植實驗證明在保存48 h時含川芎嗪的HC-A液組的腎功能指標明顯好于HC-A液組。究其原因,本研究認為與川芎嗪能保護缺血再灌注腎臟線粒體結(jié)構(gòu)的完整性、改善腎臟低溫保存及再灌注時能量代謝有關(guān)。
川芎嗪能改善腎臟低溫保存及再灌注時能量代謝,機制可能為①擴張腎血管,改善了微循環(huán)。②川芎嗪的鈣離子拮抗作用抑制了細胞的鈣離子超載,減輕低溫保存期間細胞膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上鈣泵的負荷,減少了對能量的需求,細胞內(nèi)的能量平衡因而得以長期維持[10-12]。動物器官移植實驗表明川芎嗪對腎臟缺血和再灌注損傷有保護作用,下一步可通過臨床應(yīng)用進一步加以驗證。
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