炒炭前后茜草中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量的UPLC測(cè)定△

單鳴秋，陳星，王侃，丁安偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046）

炒炭前后茜草中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量的UPLC測(cè)定△

單鳴秋*，陳星，王侃，丁安偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046）

目的：建立茜草及茜草炭中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的UPLC測(cè)定方法。方法：采用Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm），流動(dòng)相為甲醇-0.3%甲酸水，梯度洗脫，流速為0.2 mL·min-1，進(jìn)樣量為2μL，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。結(jié)果：1，3，6-三羥基2-甲基蒽醌在1.66～82.98μg·mL-1線性關(guān)系良好（r＝0.999 7），平均回收率為101.47%，RSD＝1.92%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，為優(yōu)選茜草炭炮制工藝和建立茜草炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

茜草；炒炭；1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌；UPLC

茜草為茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根莖［1］。茜草炭為茜草的炮制品，炒炭后寒性減弱，性變收澀，以止血為主?，F(xiàn)代藥理研究表明茜草炭止血作用增強(qiáng)，表現(xiàn)為復(fù)鈣時(shí)間、凝血酶原時(shí)間及白陶土部分凝血酶時(shí)間縮短［2］。 《中國(guó)藥典》2010版一部以大葉茜草素和羥基茜草素的含量來控制茜草藥材和飲片的質(zhì)量［1］，但對(duì)茜草炭沒有作相應(yīng)的規(guī)定。目前對(duì)茜草炭中的化學(xué)成分及其含量的研究較少。本實(shí)驗(yàn)利用UPLC法對(duì)茜草及茜草炭中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的含量進(jìn)行了測(cè)定，比較和分析了炒炭前后含量變化的情況，為優(yōu)選茜草炭炮制工藝和建立茜草炭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters AcquityTM超高效液相色譜儀（包括：四元溶劑泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，光電二極管陣列檢測(cè)器）；MASSLynxv 4.1數(shù)據(jù)工作站：超聲機(jī)（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司，KH-500B）；BP211D電子天平（d＝0.01 mg，Sartorius）。

1，3，6 -三羥基-2-甲基蒽醌對(duì)照品（自制，純度97.4%）。甲醇和甲酸均為色譜純，重蒸水自制。茜草購(gòu)買于全國(guó)各地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳啟南教授鑒定均為茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 茜草炭的制備

按照 《中國(guó)藥典》2010版一部的有關(guān)規(guī)定，每批茜草取100 g，炒至表面焦黑色。

2.2 色譜條件

Acquity BEHC18色譜柱 （2.1 mm ×50 mm，1.7μm）；流動(dòng)相為0.3%甲酸（A） -甲醇（B）；梯度洗脫如下：0～1 min，A為 90% ～90%；1～4 min，A為90% ～65%；4～9 min，A為65% ～40%；9～15 min，40% ～30%；15～20 min，30%～10%；20～22 min，10%～90%。流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL；DAD掃描：190～400 nm，經(jīng)選擇在276 nm下進(jìn)行測(cè)定。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌對(duì)照品4.26 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得對(duì)照品溶液。UPLC圖見圖1。

2.4 供試品溶液的制備

取茜草及茜草炭粉末（過2號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置于50 m L具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，靜置，上清液過0.22μm微孔濾膜，取濾液作為供試品溶液［3-5］。UPLC圖見圖2、3。

圖1 1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌對(duì)照品UPLC圖

圖2 茜草UPLC圖

圖3 茜草炭UPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.5，5.0 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液濃度X（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝77 881.38X-9 557.54（r＝0.999 7）。結(jié)果表明 1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌在1.66～82.98μg·mL-1與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取茜草炭樣品（產(chǎn)地：陜西，批號(hào)：101127）1份，照2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌峰面積的RSD＝1.95%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取茜草炭樣品（產(chǎn)地：陜西，批號(hào)：101127），按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的平均含量為0.794 mg·g-1，RSD＝2.21%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.6項(xiàng)下供試品溶液，室溫下放置，在上述色譜條件下分別于0，1，2，4，6，8 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌色譜峰面積的RSD＝1.59%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

取茜草炭樣品（產(chǎn)地：陜西，批號(hào)：101127）6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌對(duì)照品溶液1.2 mL，照2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 茜草炭中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌回收率試驗(yàn)

2.10 樣品測(cè)定

取各批次茜草及茜草炭樣品約0.5 g，精密稱定，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，茜草和茜草炭供試品溶液均采用二極管陣列檢測(cè)器在190～400 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。經(jīng)過比較，在276 nm處，1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌具有較強(qiáng)吸收，色譜峰峰形較好且基線平穩(wěn)，因此選擇作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 樣品中1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌的含量（n＝3）/mg·g-1

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茜草炒炭后1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量顯著升高。究其原因，可能是茜草中含有較多的以其為苷元的糖苷［6］，如1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-（O-6-乙酰基）新橙皮苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-新橙皮苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-（O-6-乙酰基）-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖（1-2）-β-D（6-O-乙?；┻拎咸烟擒盏龋诔刺窟^程中，上述糖苷的苷鍵斷裂釋放出苷元。

目前對(duì)茜草炭有關(guān)化學(xué)成分的研究較少，主要集中在大葉茜草素、羥基茜草素和1，3-二羥基蒽醌等3種成分［3-5］，但是炒炭后前者含量大幅降低，后兩者絕對(duì)含量很低，均不適于作為指標(biāo)性成分；而炒炭后1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌顯著升高，在茜草炭中為主要成分，符合作為含量測(cè)定指標(biāo)的要求。因此本實(shí)驗(yàn)以此為指標(biāo)，建立了測(cè)定其含量的UPLC方法，并經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，較HPLC法更加快速、準(zhǔn)確，可以為茜草炭飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立及茜草炭炮制工藝的優(yōu)選提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)于茜草炭止血作用的增強(qiáng)與1，3，6-三羥基-2-甲基蒽醌含量變化之間的具體關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：218-219.

［2］張衛(wèi)華，張振凌，黃顯峰，等.茜草炭飲片炒炭前后止血機(jī)制的比較［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2006，21（3）：160-162.

［3］張振凌，周艷，張本山.茜草飲片炒炭前后大葉茜草素含量比較［J］.中國(guó)中藥雜志，2005，30（5）：393-394.

［4］康輝，張振凌，周艷，等.HPLC測(cè)定茜草炭飲片中1，3-二羥基蒽醌含量［J］.中成藥，2010，32（6）：980-982.

［5］楊宇婷，康文藝.HPLC法測(cè)定茜草及不同炮制品中大葉茜草素［J］.中成藥，2011，33（12）：2125-2127.

［6］張琳，彭亮，胡本祥.茜草的化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥，2008，28（2）：52-54.

Determ ination of 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after Prepared by UPLC

SHAN Ming-qiu，CHEN Xing，WANG Kan，DING An-wei
（Nanjing University of ChineseMedicine，Jiangsu Key Laboratory for High Technology Research of TCM Formulae，Nanjing210046，China）

Objective：To establish an UPLC method for 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after prepared.Methods：An Acquity BEHC18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）column was used with methanol and 0.3%formic acid solution as themobile phase.The flow rate was0.2mL·min-1and volume of injection was 2μL.Column temperature was 30℃ and detective wavelength was 276 nm.Results：There was good liner relationshi Pbetween the peak area and concentration at ranges of 1.66～82.98μg·mL-1（r＝0.999 7）for1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone.The average recovery ratewas101.47%（RSD＝1.92%）.Conclusion：Themethod was rapid and simple with good accuracy and reproducibility for determination of 1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone in Rubiae Radix et Rhizoma before and after prepared.

Rubiae Radix et Rhizoma；Carbonizing；1，3，6-trihydroxy-2-methylanthraquinone；UPLC

2012-06-19）

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（20110700708）；《中國(guó)藥典》2015年版課題——茜草炭的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

*［通訊作者］單鳴秋，E-mail：shanmingqiu＠163.com