施學(xué)驕，張杰紅，樊丹青，劉友平

《中國藥典》2010年版規(guī)定枳實、枳殼均來源于蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥果實[1]。因采收期不同而成為不同的兩味藥，枳實5~6月收集自落果實，枳殼7月果皮尚綠時采收。黃酮、生物堿、揮發(fā)油是其主要藥理活性成分，其中枳實揮發(fā)油對耐藥金黃色葡萄球菌有抑制作用[2]，為解決臨床治療耐藥金黃色葡萄球菌感染提供了依據(jù)。

以往文獻(xiàn)對枳實、枳殼揮發(fā)油的研究多集中在枳殼或枳實揮發(fā)油成分的分析，也有對枳實揮發(fā)油抑菌實驗的研究[2~6]，但二者在不同生長期的揮發(fā)油成分動態(tài)累積變化對抑菌活性的影響研究尚未見相關(guān)報道。影響中藥藥效的因素有很多，其中氣候?qū)ζ浯紊x產(chǎn)物的累積有重要影響，并且中藥中存在很多來源相同因采收期不同而分為兩味藥單獨使用的，比如陳皮和青皮、枳實和枳殼等。因此，比較分析枳實、枳殼揮發(fā)油的成分差異與抑菌活性，為解決細(xì)菌對抗生素的耐藥性、尋求天然副作用較小的中藥抗菌活性成分提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 7890A GC System，PYXDHS-40×50-S隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），AIR TECH無菌操作臺（蘇凈集團安秦公司）。

1.2 材料

實驗用枳實、枳殼原藥材購于湖南省沅江市地產(chǎn)藥材收購站，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。乙醚等試劑為分析純，水為雙蒸水，所用標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26002]、標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌[CMCC（B）44102]均購自成都市食品藥品檢定所，其余為臨床分離菌株，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 枳實、枳殼揮發(fā)油的提取

參考《中國藥典》2010年版附錄XD甲法提取。提取的揮發(fā)油用無水Na2SO4干燥，封裝備用。

2.2 枳實、枳殼揮發(fā)油的定性與定量分析

2.2.1 氣相色譜分析條件 色譜柱為Agilent 19091S-433HP-5MS(0.25 mm×30 m×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為氦氣，流量：1.0 mL/min；分流比10：1，進(jìn)樣量1 μL；升溫程序柱溫60 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至80 ℃，再以5 ℃/min升至120℃，再2 ℃/min升至160 ℃，最后以15 ℃/min升至260 ℃，然后保持至分析完成。

2.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件 電離方式：EI，電子轟擊能：70eV；離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃；掃描范圍：50～400 amu；掃描頻率：2.1次/s。

2.3 枳實、枳殼揮發(fā)油的體外抑菌試驗

細(xì)菌培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯，用抑菌圈直徑(mm)的大小表示抑菌效力。

3 結(jié)果

3.1 枳實、枳殼揮發(fā)油成分的鑒定

枳實、枳殼揮發(fā)油取適量用乙醚溶解稀釋，過0.22 μm微孔濾膜。揮發(fā)油GC-MS的總離子流圖見圖1、圖2。對各峰經(jīng)MS掃描后得MS圖，經(jīng)過質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索（質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST08）與CAS號查詢，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，綜合各項分析鑒定，確定其成分，結(jié)果見表1。

表1 枳實、枳殼揮發(fā)油的化學(xué)成分

35 苯甲醛 C7H6O 0.02 36 香茅醛 C10H18O 0.07 37 龍腦 C10H18O 0.03 38 三甲基苯甲醇 C10H14O 0.22 39 2,3-二氫-2,2,6-三甲基苯甲醛 C10H14O 0.03 40 百里香酚醚 C11H16O 0.36 41 胡椒酮 C10H16O 0.03 42 2-(甲氨基)苯甲酸甲酯 C9H11NO2 0.08 43 [3S-(3α,3Aβ,5α)]-1,2,3,3A,4,5,6,7-八氫化-α,α-3,8-四甲基-5-奧甲醇 C15H26O 0.06 0.12 44 植酮 C18H36O 0.03 0.26 45 亞油酸甲酯 C19H34O2 0.37 1.21 46 蛇床子素 C15H16O3 0.08 1.36 47 3,6-二氫-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃 C10H16O 0.07 48 香茅醇 C10H20O 0.2 49 壬酸 C9H18O2 0.05 50 十一醛 C11H22O 0.15 51 癸酸 C10H20O2 0.12 52 合金歡醇 C15H26O 0.08 53 油酸 C18H34O2 0.37

3.2 枳實、枳殼揮發(fā)油的抑菌效果觀察

3.2.1 抑菌活性實驗 (1)鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

稱取鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，加無菌水適量配制成5 g L-1，用無菌水稀釋并定容成0.05 μg mL-1做標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

(2)增菌培養(yǎng) 取標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌、標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌菌株少許，接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18h。

(3)抑菌效果 取20 mL熔化后的營養(yǎng)瓊脂倒入9 cm平板，待其凝固。用移液槍吸取0.1 mL菌液均勻涂布于凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌鋼管打3個孔，注入0.05 mL揮發(fā)油，每塊平板涂布一種實驗菌；以鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照；以含適量聚山梨酯80的生理鹽水作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)24 h后，用直尺測量抑菌圈直徑，結(jié)果用抑菌環(huán)直徑（mm）表示，觀察各自抑菌活性，見表2。

表2 枳實、枳殼揮發(fā)油的抑菌活性

從表2可知，枳實、枳殼揮發(fā)油對各細(xì)菌均有抑菌效果，枳實、枳殼揮發(fā)油對不同的細(xì)菌有不同的抑菌作用，對同一細(xì)菌的抑菌作用存在差異。從總體來看，枳殼揮發(fā)油的抑菌活性相對較強，標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌活性比枳實、枳殼較強。

3.2.2 最低抑菌濃度實驗 (1)樣品配制 分別精密吸取枳實、枳殼揮發(fā)油1.5 mL并稱重，用含適量聚山梨酯80的生理鹽水稀釋成1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512后，制成無菌樣品，備用。

(2)最低抑菌濃度測試 取1.5 mL的稀釋藥液放入12.5 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后倒入9 cm平板，待其凝固后分別接種上述細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，結(jié)果見表3。

表3 枳實、枳殼揮發(fā)油最低抑菌濃度(MIC)/g?L-1

從表3可以看出，枳實、枳殼揮發(fā)油對各實驗菌均有抑制作用，其中枳殼揮發(fā)油對銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度幾乎是枳實揮發(fā)油的兩倍，而對其它細(xì)菌的最低抑菌濃度相差不大。

4 討論

4.1 枳實、枳殼揮發(fā)油不僅在化學(xué)成分的種類上存在差異，而且各成分的含量也不同。檸檬烯、芳樟醇、alpha-松油醇是二者共有成分中含量最高的三種，除alpha-松油醇外，其它兩種成分均是枳實中含量高于枳殼。其中檸檬烯有鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌的作用；芳樟醇有防腐、抗病毒、鎮(zhèn)靜作用[7]。

4.2 通過觀察提取的揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)枳殼揮發(fā)油的顏色較枳實深，枳殼為深黃色，枳實為淺黃色，且枳實揮發(fā)油的提取率高于枳殼。結(jié)合揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果，枳殼中大分子化合物含量高于枳實，小分子化合物含量低于枳實。隨著生長期的延長，揮發(fā)油的總量在減少，小分子化合物含量在減少，大分子化合物含量在增加，這可能導(dǎo)致枳實、枳殼揮發(fā)油在顏色上的差異。抑菌實驗的結(jié)果也顯示枳殼揮發(fā)油的抑菌效果強于枳實，是否與小分子化合物含量減少和大分子化合物含量增加有聯(lián)系需進(jìn)一步深入研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:230.

[2] 廖鳳霞,孫冠蕓,楊致邦,等.枳實揮發(fā)油的化學(xué)成分分析及其抗菌活性的研究[J].中草藥,2004,35(1):20.

[3] 龔千鋒,鐘凌云,曹君,等.不同產(chǎn)地枳殼飲片炮制前后揮發(fā)油GC-MS分析[J].中成藥,2007,29(11):1639.

[4] 廖鳳霞,辛龍濤,陳華,等.中藥枳實與枳殼揮發(fā)油成分對比分析[J].重慶大學(xué)學(xué)報,2004,27(5):38.

[5] 曹君,王少軍,龔千鋒,等.不同產(chǎn)地枳殼飲片炮制前后揮發(fā)油成分的GC-MS分析[J].中草藥,2005,36(2):172.

[6] 蔣以號,楊先玉,張慶華,等.枳殼樟幫法炮制前后揮發(fā)油的GC-MS分析[J].中藥材,2010,33(8):1233.

[7] 孫文基,馬力,黃承鈺,等.天然活性成分簡明手冊[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1998.